腹泻是以大便次数频多、粪质稀薄或呈水样便为临床特征的一种疾病，病因是多种因素所导致的肠道水液代谢紊乱[1]。水通道蛋白(AQPs)是负责跨细胞转运水分子的主要蛋白，对水具有极高通透性但对其他小分子没有通透性，与腹泻、便秘、应激、哮喘及炎症性疾病等多种代谢性疾病密切相关[2]。AQP4是AQPs中的一员，广泛表达于消化系统各器官，对于维持结肠的水吸收平衡至关重要[3],而在腹泻的发生过程中，炎性因子分泌所引起的炎症反应能够导致AQPs功能发生改变[4]。滇白珠为杜鹃花科植物滇白珠的干燥根或全草，具有清热解毒、活血通络、祛风除湿、顺气平喘功效[5],前期研究发现滇白珠提取物[6]及其乙酸乙酯萃取部位[7]均具有显著抑制胃肠运动功能及止泻作用，但其具体作用机制尚不明确。本实验通过灌胃番泻叶制备腹泻大鼠模型，通过检测腹泻大鼠结肠组织AQP4基因蛋白表达水平及血清炎性因子C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-6含量的变化，探讨滇白珠止泻的作用途径和机制。

1、材料与方法

1.1 材料

成年健康SD大鼠60只，体质量100～120 g, SPF级，雄性，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2014-0002。饲养环境：温度24～26 ℃,相对湿度50%～70%,自由进水饮食。滇白珠药材，购自广西金秀县桐木镇药材市场，经广西壮族自治区中医药研究院中药资源研究所严克俭副主任药师鉴定确认为杜鹃花科植物滇白珠的全株，滇白珠乙酸乙酯部位(简称滇白珠-YSYZ,下同)制备方法：滇白珠饮片→水提取、70%乙醇沉淀→上清液浓缩成药膏→依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取→取乙酸乙酯药液浓缩成药膏。1 g药膏相当于125 g生药，批号20190123,实验时以2%吐温-80助溶配制，置4 ℃冰箱保存；番泻叶，国药乐仁堂河北药业有限公司，实验时制成20%番泻叶药液使用；盐酸洛哌丁胺胶囊(易蒙停),西安杨森制药有限公司；大鼠CRP、TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，均购自广州德为生物科技有限公司；12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)快速制备试剂盒，购自EpiZyme公司；AQP4抗体，购自Abcam公司；GAPDH抗体、HRP标记抗体、抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒，均购自proteintech公司；动物组织总RNA提取试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂、FastKing cDNA第一链合成试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；AQP4引物由TAKARA设计合成。

1.2 动物模型制备及分组给药

采用20%番泻叶药液灌胃法制备大鼠腹泻模型，将60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、易蒙停组和滇白珠活性组分高、中、低剂量组共6组，每组10只。滇白珠活性组分高、中、低剂量组予以滇白珠-YSYZ药液灌胃，剂量分别为0.16,0.08,0.04 g/kg, 易蒙停组予以0.006 g/kg药液灌胃，正常对照组及模型组予以相同容积溶媒，每天灌胃1次，持续给药12 d。第3天起，除正常对照组外，其余5组每天灌胃给药1 h后，予以 20%番泻叶药液10 ml/kg灌胃制备腹泻模型，1次/d, 连续9 d。

1.3 标本采集

第12天末次给药后1 h(末次灌胃番泻叶后24 h),各组以戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，腹主动脉采血，离心取血清，分装血清冻存；分离结肠组织，分别用4%多聚甲醛固定、RNA保存液及-80 ℃冰箱冻存。

1.4 稀便率、平均稀便级及腹泻指数检测

末次番泻叶灌胃(给药第11天)后立即将大鼠单只放入大鼠笼内(下接带滤纸便盆),观察并记录5 h内每间隔1 h大鼠的正常便数、稀便数、稀便级，计算稀便率、平均稀便级及腹泻指数。稀便率=总排稀便点数/总排便点数 ×100%。稀便级表示稀便的稀稠程度。依据稀便污染滤纸的直径(Φ)分为4级；1 级：Φ<1 cm; 2 级：Φ为 1 ～ 2 cm; 3 级：Φ为 3 ～ 4 cm; 4 级：Φ>4 cm。腹泻指数 = 稀便率 × 平均稀便级。

1.5 血清CRP、TNF-α和IL-6含量测定

各组取血清，按照试剂盒说明，应用ELISA检测血清CRP、TNF-α和IL-6含量。

1.6 结肠组织AQP4 mRNA的表达

各组取部分结肠组织，置RNA保存液中于-20 ℃保存。检测时，取10～20 mg结肠组织标本，根据试剂盒说明提取总RNA后合成 cDNA。合成好的cDNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增，反应体系(20 μl)为：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl, 正反引物(10 μmol/L)各 0.6 μl, RNase-Free ddH2O 7 μl, cDNA模板1.8 μl; 扩增反应条件为： 95 ℃预变性15 min, 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火延伸20 s, 40个循环。以管家基因GAPDH作为内控基因，对溶解曲线进行分析，检测AQP4 mRNA 表达，按照2-△△Ct法数据的相对表达量进行分析。扩增用引物序列：AQP4正向引物：5′-AGGCAATGTGTGCACTGCTCTA-3′,反向：5′-GAAGGTGTCAACGTCACACAACAA-3′;GAPDH正向引物：5′-GACAGCCGCATCTTCTT-3′,反向：5′-GAGA AGGCAGCCCTGGTAAC-3′。

1.7 免疫组化法检测结肠组织AQP4蛋白表达

各组取部分结肠组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱水，以柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，根据试剂盒说明操作，以1∶100 AQP4抗体孵育，置冰箱4 ℃过夜后，以1∶200二抗(HRP-山羊抗兔)于室温下孵育50 min, 二氨基联苯胺(DAB)显色，Mayer免疫组化苏木素复染，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。棕黄色为AQP4阳性表达产物。

Western印迹法：各组取部分结肠组织，置于-80 ℃冰箱保存。检测时，取出结肠组织，匀浆，每20 mg组织加150 μl混合裂解液提取总蛋白，核酸检测仪进行蛋白定量； 每组取等量蛋白上样，12.5% PAGE恒定电压150 V电泳分离50 min, 电流120 mA 90 min转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用5%脱脂奶粉摇床封闭1 h后，以1∶200 AQP4抗体孵育(5%脱脂奶粉稀释),4 ℃摇床孵育过夜，TBST缓冲液充分洗膜后，以1∶5 000二抗室温摇床孵育1 h, 电化学发光(ECL)法，暗室曝光，扫描并分析软件测定条带吸光值。用一、二抗去除液处理PVDF 膜后，同法再检测内参GAPDH(GAPDH工作液浓度：1∶1 000)。以每组测定指标条带与各自GAPDH条带的吸光值比值，来表示该指标蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2、结果

2.1 各组稀便率、稀便级、腹泻系数比较

与正常对照组比较，模型组稀便率、稀便级及腹泻次数均显著增加(P<0.05);与模型组比较，滇白珠-YSYZ高剂量组、易蒙停组均能显著降低稀便率、稀便级及腹泻系数(P<0.05),滇白珠-YSYZ中剂量能显著降低稀便率、腹泻系数(P<0.05),滇白珠-YSYZ低剂量能显著降低腹泻系数(P<0.05)。见表1。

2.2 各组血清CRP、TNF-α和IL-6含量比较

与正常对照组比较，模型组血清CRP、TNF-α显著升高(P<0.05);与模型组比较，滇白珠-YSYZ高剂量组血清CRP、TNF-α含量显著降低(P<0.05),滇白珠-YSYZ中、低剂量组血清CRP含量明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3 各组结肠组织AQP4mRNA和蛋白表达比较

与正常组比较，模型组结肠组织AQP4 mRNA和蛋白表达水平及各给药组结肠组织AQP4蛋白表达量显著下降(P<0.05);与模型组比较，滇白珠-YSYZ高剂量组结肠组织AQP4 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。见表1和图1。

与正常对照组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05

表1 6组稀便率、稀便级、腹泻系数、CRP、TNF-α、IL-6、AQP4 mRNA及蛋白比较

2.4 免疫组化法检测结肠组织AQP4 蛋白表达

正常组AQP4蛋白阳性面积[(20.50±0.03)%]在结肠肠绒毛上面的杯状上皮细胞高；模型组结肠组织肠绒毛上面的杯状上皮细胞多有脱落、坏死，AQP4蛋白阳性面积较正常组明显减小[(4.77±0.06)%,P<0.05];与模型组比较，易蒙停组、滇白珠-YSYZ高、中、低剂量组结肠肠绒毛上面的杯状上皮细胞AQP4蛋白阳性面积明显较大[(11.89±0.07)%、(35.03±0.04)%、(16.51±0.02)%、(9.07±0.01)%,P<0.05],其中高、中剂量组AQP4蛋白阳性面积明显大于易蒙停和低剂量组(P<0.05)。见图2。

图1 Western印迹检测各组结肠组织中 AQP4蛋白表达

图2 各组结肠组织AQP4阳性表达(免疫组化，×200)

3、讨论

腹泻为临床常见病、多发病，番泻叶是一种刺激性泻剂，适当剂量灌胃能使大鼠肠道蠕动增加，刺激肠道激活炎症因子，同时抑制肠道水分消化吸收，使肠壁黏膜受损，促进大肠排空，造成大鼠腹泻，症状与临床类似，是常用的实验性腹泻模型[8,9]。

腹泻发生机制复杂，其中炎症反应至关重要。TNF-α、IL-6能够激发促进肠道炎症进程，引起肠道黏膜水肿、重新，加重肠道黏膜损伤，甚至出现糜烂、出血等病理改变[10]。CRP是评价组织损伤和炎症反应的关键指标，正常状态下，机体血清CRP水平较低，炎症发生后血清CRP水平会迅速升高，可以作为腹泻诊治标准[11]。研究表明[12],感染性腹泻患者血清中CRP、TNF-α和IL-6等炎性因子水平及内毒素水平出现显著性上升。中医药治疗腹泻效果显著，金海平等[13]采用丁桂散进行穴位贴敷护理联合蒙脱石散治疗，能够显著降低小儿腹泻患儿血清 IL-6 和 TNF-α 水平。高东等[14]用解毒祛湿化浊汤联合中药保留灌肠治疗，可显著降低溃疡性结肠炎腹泻活动期患者血清的IL-6、TNF-α、CRP 水平。

结肠的主要作用是重吸收水和少量无机盐，使经过小肠排入的食物残渣转变为粪便，结肠功能异常会导致腹泻或便秘[3]。结肠中水的吸收主要经过跨细胞转运途径，水的吸收与粪便成形密切相关[4]。AQPs是负责跨细胞转运水分子的主要蛋白，能够在各类动植物细胞和病毒中高效、有选择性地转运细胞内外水分子，从而维持内环境的水液平衡[15]。AQPs与腹泻、便秘、应激、哮喘及炎症性疾病等多种代谢性疾病密切相关，AQPs在肠道内的表达部位、表达数量及活性结构改变，与各种类型肠道腹泻(包括感染性腹泻、非感染性腹泻、化学药物腹泻、炎症性和疾病性腹泻等)的各个阶段具有非常密切关系，AQPs 在肠道表达异常，会直接造成肠道内环境的水液平衡破坏，水分在肠道内的吸收减少，从而在外大量累积导致腹泻发生[16,17]。AQP4参与介导水分子的跨膜转运，它广泛表达于消化系统各器官，对于维持结肠的水吸收平衡至关重要。研究发现[18],AQP4参与了结肠对肠腔内水分的吸收，AQP4 基因敲除鼠全结肠对水的通透性均显著下降。王晓玲等[3]研究发现，腹泻状态下大鼠结肠黏膜 AQP4 表达下调，结肠对肠腔内水分的吸收减少，引起大便稀薄，含水量增加形成腹泻。因此，腹泻的发生过程中结肠AQP4表达下调导致水液代谢紊乱是至关重要的因素。

药理研究表明[19],滇白珠具有调节胃肠功能、抗炎镇痛、抑菌、抗氧化、治疗呼吸系统疾病、治疗眩晕等广泛的药理作用。滇白珠可能通过上调AQP4蛋白和mRNA 表达，调节炎症因子水平，增强结肠对水分的重吸收而发挥止泻作用。

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基金资助:广西自然科学面上项目(2017GXNSFAA198264);

文章来源:王丽,苏华,何飞,等.滇白珠对腹泻大鼠结肠组织水通道蛋白4及炎性因子表达的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(15):3769-3773.