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长期抗病毒治疗HIV-1感染者体内CD39+NK细胞的表达特点分析

2020-08-31 442 上传者：管理员

摘要：目的通过分析接受长期抗病毒治疗(ART)的1型艾滋病病毒(HIV-1)感染者体内CD39+NK细胞的频率和表型特征,探索其与主要临床指标的关系及临床意义。方法本研究入组10例健康对照(HCs)和28例长期接受ART的HIV-1感染者。利用流式细胞术检测NK细胞亚群分布以及NK细胞上CD39的表达情况,分析CD39+NK细胞亚群比例与CD4、CD8+T淋巴细胞(简称CD4、CD8细胞)计数、以及CD4/CD8细胞比值的相关性。结果28例长期接受ART的HIV-1感染者中,18例免疫重建成功患者(CRs)和10例免疫重建失败患者(INRs)。相较于HCs和CRs组,INRs组CD56dim亚群比例明显下降(平均值94.75%vs.82.65%,P<0.01；平均值93.20%vs.82.65%,P<0.001);INRs组CD39+NK细胞的频率明显高于CRs组(平均值21.45%vs.7.79%,P<0.05)和HCs组(平均值21.45%vs.4.115%,P<0.001)；长期接受ART的HIV-1感染者CD39+NK细胞占比与其CD4/CD8细胞比值呈负相关(r=-0.3924,P=0.0389)。结论免疫重建失败患者外周血中CD39+NK细胞表达频率明显高于免疫重建成功患者,HIV-1慢性感染者外周血CD39+NK细胞表达增加伴随着CD4/CD8细胞比值的降低。

关键词：
CD39
免疫重建失败
自然杀伤细胞
艾滋病病毒
长期抗病毒治疗
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自然杀伤细胞（naturalkillercell,NK细胞）是天然免疫系统的重要组成部分，在控制病毒感染中发挥重要作用，是抗病毒感染的第一道防线[1]。外周血中，NK细胞占所有单个核细胞的5%～15%，根据NK细胞表面CD56和CD16表达的差异，分为三个不同的群体，即CD56bri,CD56dim和CD56negNK细胞。

CD39是一种胞外核苷酸酶，在T细胞、B细胞、NK细胞中均有表达，与CD73一起将促炎的细胞外三磷酸腺苷（ATP）降解为二磷酸腺苷或单磷酸腺苷，进而转化为抗炎的腺苷[2]，以自分泌和旁分泌的方式调节免疫应答。已有研究[3]显示，在1型艾滋病病毒（HIV-1）慢性感染者中，CD39在CD4+T淋巴细胞（简称CD4细胞）上表达升高，且与疾病进展相关。在未经抗病毒治疗（ART）的HIV-1感染者中，CD39主要表达于CD56briNK细胞亚群中[4]。本研究入组了免疫重建成功患者（CRs）组，免疫重建失败患者（INRs）组及健康对照组（HCs），通过分析CD39+NK细胞在HIV-1慢性感染者体内的频率和表型特征，从而探索其与主要临床指标的关系。

1、对象与方法

1.1对象

2018年7月至2019年12月期间在解放军总医院第五医学中心收治的经ART>2年的HIV-1感染者，共28例，另选10例HIV-1检测指标均阴性的健康体检者作为健康对照；诊断标准均依据中国艾滋病诊断指南（2018版），且排除肿瘤、乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒感染、自身免疫性疾病及其他基础疾病。本研究经本单位伦理委员会批准（R2016201DA020），且所有入组对象均签署知情同意书。

1.2方法

1）人外周血单个核细胞（PBMCs）分离：用EDTA-K2真空采血管分别采集入组对象静脉血2mL、5mL,24小时内测定CD4细胞数；另一管吸取上层血浆，用于检测病毒载量，剩余细胞采用密度梯度离心法，使用淋巴细胞分离液分离PBMCs。

2）全血CD4细胞、CD8+T淋巴细胞（简称CD8细胞）计数：吸取50μLHIV-1感染者EDTA抗凝全血置于TruCount管混匀，加入CD3/CD4/CD8/CD45组合抗体，流式细胞仪检测CD4、CD8细胞绝对计数。FACSCalibur型流式细胞分析仪检测CD4、CD8细胞绝对数。实验所用试剂均购于美国BD公司。

3）血浆HIV-1RNA病毒载量检测：采用HIV-1套式反转录荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，在CFX96TMReal-Timesystem型荧光定量聚合酶链反应分析仪（BIO-RAD）上定量检测样本血浆中HIV-1核糖核酸（RNA），核酸检测范围为50～1.8×108拷贝/mL。

4）流式细胞染色：取100μL样本细胞悬液，浓度为1×106个细胞/100μL，加入表面染色抗体CD3/CD14/CD20-APC-Fire750、CD16-Percp、CD56-BV421、CD39-APC，以上试剂均购于美国Biolegend公司。混合均匀后，置于4℃冰箱孵育30min，加入1mLPBS，震荡混匀，洗涤（1500rpm,5min），洗涤离心后弃上清，加1%多聚甲醛溶液300μL固定，用FACSCanto型流式细胞分析仪24h内上机检测。流式数据通过FlowJo软件进行分析。

5)NK细胞圈门策略：先圈出淋巴细胞群，再圈出单个细胞，再去除T、B细胞（CD3-CD14-CD20-），然后根据CD56和CD16圈出总NK细胞群，最后圈出NK细胞三个亚群CD56briNK细胞（CD56++CD16+/-）、CD56dimNK细胞（CD56+CD16+/-）和CD56negNK细胞（CD56-CD16+）。

1.3统计方法

实验结果分析运用GraphPadPrism8.0软件，组间比较分析采用Mann-WhitneyU检验；相关性分析采用Spearman相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1入组对象基本信息

经每半年或者1年检测1次、ART>2年的HIV-1感染者28例，其中18例CRs患者，CD4细胞计数持续>350个/μL，病毒载量低于检测下限（≤50拷贝/mL);10例INRs患者，期间CD4细胞计数持续<200个/μL，病毒载量低于检测下限（≤50拷贝/mL）。详见表1。

表1研究对象基本信息

2.2三个NK细胞亚群在总NK细胞中的比例检测

NK细胞亚群流式分析典型图见图1A。通过对三组NK细胞亚群在总NK细胞中的比例进行统计学分析发现，INRs组CD56dimNK细胞在总NK细胞中的比例明显低于CRs组（平均值82.65%vs.93.20%,P<0.001）和HCs组（平均值82.65%vs.94.75%,P<0.01）；而INRs组的CD56negNK细胞在总NK细胞中的比例明显高于HCs组（平均值5.81%vs.0.58%,P<0.01）（如图1B所示）。

图1典型流式图及NK细胞亚群占比图

2.3INRs患者中CD39+NK细胞表达频率增加

CD39+NK细胞典型流式见图2A。三组研究对象NK细胞表面CD39的表达情况见图2B。结果显示：HCs组中，NK细胞低表达CD39（平均值4.115%);INRs组CD39在总NK细胞中频率明显高于CRs组（平均值21.45%vs.7.79%,P<0.05）和HCs组（21.45%vs.4.115%,P<0.001）；同时还证实了与HCs和CRs组患者相比，INR患者CD56dimNK细胞中CD39表达频率增加（22.25%vs.3.6%,P<0.001;22.25%vs.6.895%,P<0.05）。

图2CD39在NK细胞中的表达

2.4长期接受ART的HIV-1感染者CD39+NK细胞表达频率与CD4/CD8细胞比值负相关

经对长期接受ART的HIV-1感染者（文中包括CRs组和INRs组研究对象）进行该亚群细胞表达频率与CD4、CD8细胞计数及其比值的相关性分析。结果显示长期接受ART的HIV-1感染者CD39+NK细胞表达频率与CD4CD8细胞值呈负相关（r=-0.3924,P=0.0389，如图3C所示）；虽然其与CD4细胞计数无明显相关性（r=-0.3442,P=0.0729），但是呈现负相关趋势（图3A）。

图3HIV-1慢性感染者CD39+NK细胞亚群表达频率与CD4/CD8细胞比值负相关

3、讨论

ART的应用，极大地降低了艾滋病的发病率和病死率，但是依然存在15%～30%的INRs患者的CD4细胞计数恢复不理想。已知免疫重建失败的可能危险因素包括：患者年龄较大、接受ART的时间较晚、免疫稳态紊乱（T细胞过度活化、炎症因子水平高、肠道微生物移位水平高等）以及抗CD4细胞抗体的产生等[5]。关于INRs患者免疫学特点的研究一直是国际研究的热点，然而NK细胞在INRs患者免疫恢复中的作用尚不清楚。CD56dimNK细胞亚群主要发挥细胞毒性杀伤功能，CD56briNK细胞亚群主要发挥细胞因子分泌功能[6]。本次研究发现，在HIV-1慢性感染阶段，与HCs组和CRs组患者相比，INRs组患者NK细胞亚群比例发生了很大的变化。CD56dimNK细胞亚群比例明显降低，提示细胞毒性杀伤功能显著减弱；与此同时，CD56briNK细胞亚群比例明显升高，提示细胞因子分泌功能明显上升。同时CD39不仅是NK细胞表面的一个激活性分子，还是免疫检查点分子，具有重要的免疫调节功能[7]。本次还主要分析了三组研究对象NK细胞表面CD39的表达情况，结果表明：HCs组中NK细胞低表达CD39，这与曾报道的实验研究中描述的观察结果一致[8]。HIV-1慢性感染者体内的CD39+NK细胞的表达比例上升，且INRs患者体内相对较高，提示INRs患者体内虽然病毒得到了很好的抑制，但是机体可能仍然处于免疫系统失衡状态。Li等[9]的研究指出，抗CD39抗体能通过抑制腺苷途径，激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤的生长。在艾滋病免疫研究中，靶向CD39对于抗感染免疫的影响，包括对NK细胞功能的影响，还需要进一步研究。由于正常人中CD56negNK细胞占比非常少，所以本文未做深入研究。

CD4/CD8细胞比值被认为是HIV-1感染者增加非艾滋病风险的一个潜在指标[10]。有研究表明：CD4CD8细胞比值和发生非艾滋病事件的风险之间存在相关性，CD4/CD8细胞比值越低，发生严重事件和死亡的风险的机会越大[11]。本研究结果显示长期接受ART的HIV-1感染者CD39+NK细胞表达频率与其CD4CD8细胞比值呈负相关，这可能是因为此时机体处于高免疫激活状态伴随CD39高表达，机体免疫稳态失衡导致CD4/CD8细胞比值降低，发生非艾滋病事件的风险增加。

综上所述，HIV感染引起了NK细胞亚群比例的改变，即使经过长期有效的ART仍无法完全恢复。INRs患者体内CD39+NK细胞表达增高，免疫系统处于失衡状态。靶向CD39可能作为恢复INRs患者免疫功能的潜在靶标。

曹文静,周明菊,李静,靳婕华,张超,范兴,周春保,宋锦文,王福生.抗病毒治疗HIV-1感染者外周血CD39~+NK细胞的表达特点[J].中国艾滋病性病,2020,26(08):801-804+808.

基金:国家科技重大专项(2018ZX10302104-002);国家自然科学基金创新群体项目(81721002);蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(Byycx1914)