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抗病毒治疗脱失的HIV感染者的毒株基因亚型和耐药分析

2020-08-31 327 上传者：管理员

摘要：目的了解云南省德宏傣族景波族自治州(简称德宏州)抗病毒治疗(ART)脱失艾滋病病毒(HIV)感染者中的体内毒株亚型及耐药发生情况。方法 2016年,采用方便抽样法随访到276例ART脱失者,采集静脉血检测其血浆HIV病毒载量(VL)；对VL≥1 000拷贝/mL的患者,通过反转录聚合酶链式反应(RTPCR)扩增HIV的pol区基因,并根据pol区基因序列进行基因亚型和耐药突变分析。结果 276例ART脱失者中,VL≥1 000拷贝/mL 196例(71.0%),pol区基因成功扩增171例(87.2%)；根据pol区基因序列确认有6种基因亚型:BC重组类型毒株76例(44.4%)、C 44例(25.7%)、CRF01＿AE 25例(14.6%)、B 11例(6.4%)、CRF08＿BC 8例(4.7%)和CRF62＿BC 7例(4.1%)。276例ART脱失者中,53例(19.2%)具有耐药突变位点,与HIV亚型分布无关联；37例(13.4%)判定为耐药:1例对核苷类反转录酶抑制剂类药物低度耐药；36例对非核苷类反转录酶抑制剂类药物有不同程度耐药,其中对奈韦拉平、依法韦仑高度耐药在BC重组类型中检出较高。结论德宏州脱失抗病毒治疗的HIV感染者体内病毒基因亚型复杂,且可能存在较高耐药率,其成为耐药毒株传播来源的风险大,应引起高度重视。

关键词：
亚型
抗病毒治疗
耐药
脱失
艾滋病病毒感染者
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广泛的抗病毒治疗（ART）显著减少艾滋病病毒（HIV）感染者病死率，有效改善HIV感染者的生存质量[1]，但HIV耐药毒株的传播给艾滋病防治工作带来了严峻挑战[2,3,4]。研究[5]表明，在低中等收入国家、治疗前耐药、开始抗病毒治疗时间、治疗监测、服药依从性、用药方案以及HIV亚型均是耐药发生的影响因素。目前国内外对HIV耐药进一步的探索，主要关注HIV原发性耐药和ART在治者治疗失败耐药，德宏州自1989年国内首次发现HIV感染者，每年都有ART脱失者；为了解治疗脱失者HIV耐药发生、基因亚型及两者之间关系，于2016年组织乡村医生开展专题调查，结果分析报告如下。

1、对象与方法

1.1对象

国家“艾滋病综合防治数据信息管理系统抗病毒治疗板块”中ART脱失的HIV感染者，本研究已通过德宏傣族景颇族自治州疾病预防控制中心伦理审查。

1.2方法

1）下载截至2015年12月31日德宏州HIV感染者ART数据库，整理脱失治疗的HIV感染者名单并下发县市、乡、村寻找脱失患者。脱失治疗是指接受ART的HIV感染者在治疗过程中因各种原因退出治疗（包括对治疗不感兴趣、身体不适不便继续治疗、移居外地等），不再接受随访领药治疗。根据国家免费艾滋病ART要求[6]，接受治疗的感染者在第0、0.5、1、2个月随访领药，之后每3个月进行一次随访领药；若其末次随访表中的“下次随访时间”之后90天无新随访表录入，则系统客户端自动判断其失访（脱失治疗）；该记录由软件客户端自动生成并上报服务器。脱失前治疗时长：开始治疗日期到脱失日期之间的时间长度。

2)HIV核糖核酸（RNA）提取，使用法国生物梅里埃公司生产的试剂盒（Nucli SENSEasy Q）及仪器（Nucli SENSEasy MAG），提取研究对象血浆HIV RNA，具体操作严格按说明书进行。

3)pol区基因扩增及测序，根据《全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）》[7]中对个体耐药检测推荐，仅对病毒载量（VL）≥1 000拷贝/mL的患者血浆进行巢式反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增HIV-1pol基因片段。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，阳性标本送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行基因测序。扩增引物及反应条件见表1。

表1 pol区扩增引物及反应条件

4)HIV基因亚型和耐药分析使用Vector NIT advance 10软件对基因序列进行编辑和拼接，Bioedit软件比对和矫正样本序列和标准参考株；用Los Alamos国家实验室HIV序列数据库（http://fahfde5603ac688d40c5a763e1af3cd147d9sqoxcpoq9oq0x6bxv.fyay.oca.swupl.edu.cn/）对所获序列进行比对，初步获得HIV亚型；下载国际HIV参考株序列，用MEGA7.0软件对最终序列和参考株进行比对，使用Neighbor-Joining(N-J）法构建系统进化树，通过判断样本序列与国际参考株亲缘关系，最终确认样本亚型。同时，将最终序列提交到美国斯坦福大学HIV耐药数据库（http://fahf293ca6e07ec741b2902fdef5cfe995d5hqoxcpoq9oq0x6bxv.fyay.oca.swupl.edu.cn/），参照世界卫生组织（WHO）耐药位点突变列表（2009）对耐药突变位点和各种抗反转录病毒药物敏感性进行分析，对任何一种药物出现低度及以上耐药即判定为耐药。

1.3统计学方法

采用Excel 2013和Stata 13.0进行数据整理和统计分析。耐药突变位点检出率=（突变位点样本数/VL检测样本总数）×100%，具多个突变位点的样本分别计入不同突变位点检出率的分子进行计算；耐药检出率=（对任意一种药物耐药样本数/VL检测样本总数）×100%。使用χ2检验和Fisher确切概率法进行构成比的比较，Logistics回归分析耐药发生的影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1治疗脱失患者人口学特征

截至2015年12月底，接受ART的成人HIV感染者累计脱失1 052例，追回276例，其中缅甸籍占19.3%(203例），访回率7.9%(16/203），未访回和访回的缅甸籍HIV感染者在性别、年龄、民族、文化程度、婚姻、职业、传播途径、基线CD4+T淋巴细胞（简称CD4细胞）计数、基线治疗方案、脱失前治疗时长等方面差异无统计学意义；中国籍访回率30.6%(260/849），详见表2。

表2德宏州1 052例脱失ART HIV感染者基本人口学特征

276例HIV感染者以男性（71.0%）、30～45岁（59.8%）、景颇族（37.3%）、已婚（49.6%）、小学及以下文化水平（74.3%）、农民（87.0%）为主，经性和静脉注射吸毒感染者约各占一半，42.4%基线CD4细胞计数为200～349个/μL。

2.2耐药检出率及影响因素

276例中，196例（71.0%)VL≥1 000拷贝/mL者进一步扩增pol区基因，其中171例（87.2%）成功扩增，发生耐药位点突变共检出53例（19.2%），由于并非所有耐药位点能引起HIV感染者对药物敏感性发生变化而导致耐药，最终判定为耐药37例，总耐药率13.4%。单因素Logistics回归分析显示，脱失治疗患者耐药发生与婚姻状况[已婚vs.未婚：比值比（OR)=0.41,95%可信区间（CI):0.18～0.91,P=0.028]有统计学关联；但在多因素Logistics回归中则不显著。详见表3。

表3 276例脱失ART HIV感染者耐药率及Logistics回归分析

2.3 HIV亚型分布与耐药的关系分析

171例成功扩增并获得基因序列者中检出6种HIV基因亚型：BC重组类型毒株76例（44.4%）、C 44例（25.7%）、CRF01＿AE 25例（14.6%）、B 11例（6.4%）、CRF08＿BC 8例（4.7%）和CRF62＿BC 7例（4.1%）。

53例耐药突变位点中，NNRTIs类药物占18.1%(50/276），以K103N/KN、V179D/E/T/VD/VDE和E138A为主，8例检出同时发生2个及以上突变位点突变；NRTIs类药物占0.4%(1/276），突变位点D67N;PIs类药物位点突变占1.1%(3/276），突变位点含L33F和K43KT，其中1例含NNRTIs类药物耐药突变位点。耐药突变位点在各HIV亚型的分布差异均无统计学意义。

37例耐药患者中，NNRTIs类药物耐药率13.0%(36/276),EFV、NVP和RPV耐药发生较其他药物普遍，EFV、NVP高度耐药在BC重组类型中检出较高；NRTIs类药物耐药率0.4%(1/276),NRTIs药物耐药情况在HIV亚型分布差异无统计学意义；无PIs耐药病例检出。详见表4。

表4 171例HIV亚型分布与耐药

3、讨论

本次研究发现，脱失治疗的HIV感染者耐药检出率显著高于在治患者[8,9]。多因素分析未发现脱失治疗HIV感染者耐药发生的显著影响因素，可能由于HIV耐药受病毒因素、药物因素和患者依从性等方面影响，模型所纳入因素非脱失治疗HIV感染者耐药发生的主要影响因素。HIV感染者体内抗病毒有效暴露浓度不足，无法有效抑制HIV复制，而病毒具高度突变性，复制过程中耐药突变位点的不断积累是最终造成个体耐药的主要原因。病毒抑制的HIV感染者体内，仍有处于静息状态的受染免疫细胞，由于不受药物和免疫机制影响，成为HIV潜伏贮存库。HIV感染者脱失治疗后，体内HIV贮存库活化继续增殖复制，易发生耐药，不仅疾病进展快、死亡风险高[10,11,12]，并且还是HIV在人群中扩散传播的重要传染源[13,14]。若脱失治疗患者携带HIV耐药毒株在人群中发生传播，必对新发感染者治疗造成影响。

脱失治疗的HIV感染者耐药发生以NNRTI为主，与云南省内其他州市的历年ART在治的人群耐药检测情况相似[15]，此次检测出PIs耐药突变位点D67N和L33F，未导致毒株发生耐药；检出1例NRITs耐药突变位点D67N，导致对AZT、D4T低度耐药；NNRITs耐药突变位点以K103N/KN突变率较高，导致对EFV、NVP的高度耐药，E138A突变导致对RPV的低度耐药，V108VI、V179VDE位点突变分别与NVP、ETR低度耐药相关。较之NRTIs和PIs,NNRTI遗传学耐药屏障和与相应酶位点结合力较低，更易发生耐药（交叉耐药）；但由于NNRTI药物毒性较小，不良反应较少，EFV和NVP依然不失为有效的一线ART药物[16]。

本研究中脱失治疗的HIV感染者的6种HIV基因亚型中BC重组类型毒株为优势株，其次为C和CRF01＿AE，这种亚型分布情况与德宏州ART在治的新发耐药HIV感染者中主要流行BC重组类型毒株、CRF01＿AE和C亚型[8]结果相近。德宏州HIV亚型分布复杂，脱失治疗的中缅籍HIV感染者中均检出多种HIV亚型且以重组毒株占较高比例。研究显示[17],HIV基因亚型是耐药遗传屏障的影响因素，但此次检出的耐药突变位点在各亚型中的分布差异无统计学意义，可能与本研究HIV基因亚型较多且样本较小有关；耐药药物除了对EFV和NVP高度耐药的情况在BC重组类型中检出率较高以外，其余耐药检出差异均无统计学意义。

提高患者治疗依从性是预防HIV耐药的重要保障，今后需要通过多层次多途径干预来避免HIV感染者治疗中断。德宏地处边境，中缅跨境交流频繁，HIV防治面临挑战：跨境流动人口HIV感染率较高，HIV传播风险较大[18]，且因其流动性大，随访管理面临诸多挑战。此次脱失治疗感染者中，缅甸籍HIV感染者中未能寻回所占比例较高。

本研究也存在一定局限性，一是采取方便抽样方法随访治疗脱失患者，访回率仅26.2%，可能使治疗脱失患者耐药结果受到影响，但成功访回者与未访回者在人口学和HIV相关特征方面具可比性，样本仍具代表性；二是本研究中VL<1 000拷贝/mL的患者未行进一步pol基因扩增和耐药分析，有低病毒载量耐药患者被遗漏的可能性[19]，但此次主要根据国家检测技术规范推荐进行检测，今后在低病毒载量耐药检测方面可进一步做些研究；提高PCR扩增及分型成功率能为耐药分析提供更多的信息。

参考文献：

[6]张福杰,王建,王福生,等.国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册[M].3版.北京:人民卫生出版社, 2012:6.

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[15]杨绍敏,钟敏,杨壁珲,等.云南省2008-2012年HIV-1耐药基因型检测情况[J].中国艾滋病性病, 2014,20(1):9-12,26.

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王继宝,石瑞紫,王译葵,周素娟,段星,姚仕堂,曹东冬,杨锦,杨世江,杨涛,叶润华,杨跃诚,丁盈盈,何纳,段松.德宏傣族景颇族自治州276例抗病毒治疗脱失的HIV感染者的毒株基因亚型和耐药分析[J].中国艾滋病性病,2020,26(08):809-813+856.

基金:国家重点地区艾滋病防治项目;国家科技重大专项(2018ZX10715006-001)