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分析骨关节炎软骨细胞受基质细胞衍生因子1诱导的miRNA表达谱

2020-06-09 146 上传者：管理员

摘要：背景：骨关节炎是多因素介导的复杂疾病，发病机制尚待挖掘，随着基因层面的不断深入研究，非编码核糖核酸调控作用显现并得以研究。通过检测软骨细胞退变miRNA表达谱变化有助于更好地理解骨软骨细胞退变的分子机制，并为骨关节炎的诊断和治疗开辟新的途径。目的：探讨基质细胞衍生因子1刺激骨关节炎软骨细胞后miRNA表达谱变化，为基因层面延缓关节软骨退变提供实验基础。方法：对10例膝关节骨关节炎患者于全膝关节置换手术过程中截骨后残留的软骨组织进行软骨细胞培养，随机分为实验组与对照组，两组细胞培养基为含体积分数10%胎牛血清及青链霉素双抗的高糖DMEM培养基。实验组培养基中另外加入100μg/L基质细胞衍生因子1，对照组不做任何处理。两组软骨细胞培养48h后，进行下一步实验用于miRNA芯片筛选和实时定量PCR验证。软骨组织标本取材前皆告知患者并征得同意，该研究符合《医疗机构管理条例》相关要求，获得昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准。结果与结论：miRNA基因芯片初筛共有84个miRNAs发生变化，其中70个miRNAs上调，14个miRNAs下调。通过基因芯片筛选差异变化的miRNA，对变化显著的7个miRNA（miR-146a-5p、miR-124-3p、miR-130a-3p、miR-185-5p、miR-221-3p、miR-126-3p）进行qRT-PCR实验验证，其中miR-146a-5p、miR-124-3p及miR-126-3p的qRT-PCR结果与基因芯片结果一致。结果表明，基质细胞衍生因子1刺激骨关节炎软骨细胞后循环miRNA表达谱出现明显变化，miR-146a-5p、miR-124-3p及miR-126-3p可能与基质细胞衍生因子1刺激骨关节炎SDF-1/CXCR4信号通路反应有关。

关键词：
miRNA芯片筛选
SDF-1/CXCR4信号通路
基质细胞衍生因子1
软骨细胞
骨关节炎
骨科疾病
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文题释义：

miRNA测序：成熟的miRNA是17-24nt的单链非编码RNA分子，通过与mRNA相互作用影响目标mRNA的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控基因表达、细胞生长、发育等生物学过程。基于第2代测序技术的microRNA测序，可以一次性获得数百万条microRNA序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的microRNA及其表达差异，为研究microRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

差异表达miRNA聚类分析：聚类分析用于判断差异基因在不同实验条件下的表达模式，可通过将表达模式相同或相近的基因聚集成类，从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能，同类基因可能具有相似的功能或共同参与同一代谢过程。对筛选出的差异表达miRNA做层次聚类分析，将具有相同或相似表达行为的miRNA进行聚类。

引言

骨关节炎是一类以软骨下骨破坏、软骨细胞减少、软骨基质降解为主要特征的慢性、进行性疾病[1]。目前的治疗方案虽对缓解疼痛有一定的疗效，但不能阻断骨关节炎的发病进程，最终发展成全关节软骨病变，导致关节活动能力丧失，甚至瘫痪在床，生活不能自理[2,3]。随着对骨关节炎认识的不断深入，其治疗策略已经从简单的药物、手术治疗逐渐过渡到分子、细胞、基因层面。骨关节炎是多因素介导的复杂疾病，其发生发展可能涉及众多因素如生长因子、炎症因子和信号通路等参与，进一步研究其作用靶点和调控因子，可能对控制关节软骨细胞的破坏和刺激修复具有重要作用[4,5]。该研究对骨关节炎膝关节软骨细胞进行体外培养(培养液含基质细胞衍生因子1)，采用高通量测序方法以及qRT-PCR检测软骨细胞内microRNA表达，探讨基质细胞衍生因子1刺激骨关节炎软骨细胞后miRNA表达谱的变化，为基因层面延缓关节软骨退变提供实验基础。

1、材料和方法

1.1设计

细胞学体外实验。

1.2时间及地点

实验于2018年1月至2019年3月在昆明医科大学完成。

1.3材料

基质细胞衍生因子1(Sigma公司，美国)；配置DMEM液[6];Cluster3.0软件；miRDB在线数据库；DAVID在线数据库3.2.0软件。

1.4实验方法

1.4.1软骨组织获取

软骨组织块来自于2018年1月至2019年3月在昆明医科大学第一附属医院接受全膝关节置换的膝关节骨关节炎患者10例，男4例，女6例，年龄55-75岁，见表1。符合ALTMAN[7]的骨关节炎诊断标准，排除有肝肾疾病、结缔组织病、内分泌疾病、严重心血管疾病及肿瘤患者。软骨组织标本取材前皆告知患者并征得同意，该研究符合《医疗机构管理条例》相关要求。收集手术过程中截骨后残留的胫骨平台及股骨髁表面的软骨组织。选取大体观评分(以Mankin’s评分为标准[8])为0分(关节面光整，色泽如常)或者1分(关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗)的软骨组织。无菌条件下将软骨组织修剪为2mm×2mm×1mm大小，每例取10块(共100块)，放入提前准备好的高糖DMEM培养基内消化培养。

表1接受全膝关节置换的膝关节骨关节炎患者信息

1.4.2实验分组

取第1代培养的骨关节炎软骨细胞，随机平均分为实验组与对照组，两组细胞培养基为含体积分数为10%胎牛血清及青链霉素双抗的高糖DMEM培养基。实验组培养基中另外加入100μg/L基质细胞衍生因子1，对照组不做任何处理。两组软骨细胞培养48h后，进行下一步实验用于miRNA芯片筛选和实时定量PCR验证。

1.4.3miRNA表达谱芯片检测

培养48h后，加入1mLTRNzol-A’Reagent裂解液提取总RNA，使用NanoDropND-2000分光光度计检测总RNA浓度及纯度，分光光度计显示RNA在260nm处具有最大吸收峰值，故使用260nm波长处吸光度值检测RNA浓度，留取软骨细胞的RNA样本，送上海鲸舟基因科技有限公司行miRNA表达谱芯片检测。

1.4.4荧光定量RT-PCR验证芯片结果

从上述两组细胞内提取总RNA后行qRT-PCR，验证miRNA基因芯片筛选结果，引物序列见表2。

表2各基因引物序列

1.5主要观察指标

光镜下细胞形态学改变、差异基因筛选、聚类分析、miRNA基因芯片结果。

1.6统计学分析

用AXON4000B荧光扫描仪扫描芯片并将扫描信号转化为数字信号，删除坏点及弱点数据。差异倍数(FoldChange)≥2倍。利用t检验计算两样本扫描信号值，获得每个探针log2(ratio)值与P值。将实验组与对照组细胞间杂交信号强度比值大于2定义为表达上调，比值小于-2定义为表达下调，筛选miRNA条件为变化倍数≥2倍，P≤0.05。采用SPSS17.0软件包进行数据分析。

2、结果

2.1细胞培养形态学变化

取第1代培养的骨关节炎软骨细胞，在加入基质细胞衍生因子1培养48h后实验组软骨细胞呈不规则形、长梭形，活细胞折光率低，结构模糊，而对照组软骨细胞呈梭形或椭圆形，胞核完整，活细胞折光率高，结构清晰，见图1。

2.2差异筛选结果

将每个基因的表达量按照在不同组间/样本间的值分别绘制在横纵坐标上，即得到差异基因的散点图，见图2。散点图显示基质细胞衍生因子1诱导后的软骨细胞出现大量的上调、下调基因。

另一种对差异基因进行展示的图形为火山图，它本质上也是一种散点图，只不过横坐标变为差异倍数，纵坐标为P值，为了做图方便，取-1*log10(P值)为纵坐标，见图3。火山图显示大量的上调、下调差异基因集中在差异倍数2-5倍之间。

2.3聚类分析

用聚类热图将表达变化的miRNA展示出来，可以直观看到基质细胞衍生因子1刺激后骨关节炎软骨细胞内所有miRNA的变化情况。颜色由蓝色变为红色，说明表达发生上调；颜色由红色变为蓝色则说明表达下调，见图4。进一步对验证的7个miRNA进行聚类分析，以直观观察其变化趋势，其中红色表示变化上调，绿色表示变化下调，见图5。

2.4miRNA基因芯片结果验证

为了减少miRNA基因芯片分析结果带来的假阴性及假阳性，从84个变化的miRNA中选取以下7个表达倍数相对高、统计学意义显著的miRNA进行进一步qRT-PCR验证，分别是miR-146a-5p、miR-221-3p、miR-126-3p、miR-185-5p、miR-155-5p、miR-124-3p、miR-130a-3p。qRT-PCR结果与基因芯片结果趋势基本一致，说明基因芯片数据基本可靠。实验组miR-185-5p、miR-155-5p、miR-221-3p及miR-130a-3p的表达与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)，实验组miR-126-3p、miR-146a-5p及miR-124-3p的表达与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)，见图6,7。

3、讨论

3.1SDF-1/CXCR4轴在骨关节炎发病中的介导作用

研究发现基质细胞衍生因子1对软骨基质降解有较强的诱导作用，SDF-1/CXCR4信号通路在骨关节炎患者软骨退变的病理进程中起关键性作用[9,10,11]。骨关节炎患者膝关节滑膜组织可产生较正常人更高浓度的基质细胞衍生因子1，与软骨表面的CXCR4特异性受体结合，形成SDF-1/CXCR4信号通路，进而激活细胞外信号调节酶(Erk)及相关激酶(P38MAPKinase)信号通路，促进软骨基质释放基质金属蛋白酶，降解软骨基质的重要组成成分Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖，从而加速软骨退变，诱发骨关节炎。CXCR4的特异性拮抗剂(TN14003、T140、AMD3100)可与基质细胞衍生因子1竞争性结合CXCR4，阻断SDF-1/CXCR4信号通路，从一定程度上减少软骨基质分泌基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13，抑制Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，减缓关节软骨退变[12,13,14]。前期研究发现CXCR4拮抗剂并不能完全抑制基质金属蛋白酶的释放，也不能使退变的软骨完全恢复至正常形态，表明该方式抑制骨关节炎病理进程有限；由于CXCR4拮抗剂抑制骨关节炎的靶点尚未完全明确，在抑制软骨退变过程中可能损伤人体其他靶器官，故目前临床尚未用于治疗骨关节炎[15]。该实验中加入基质细胞衍生因子1培养48h后软骨细胞形态学变化，同样可以证实基质细胞衍生因子1诱导软骨细胞出现退变。

图1两组膝关节骨关节炎软骨细胞形态(×100)

图2两组膝关节骨关节炎软骨细胞差异mRNA散点图

图3两组膝关节骨关节炎软骨细胞差异mRNA火山图

图4两组膝关节骨关节炎软骨细胞内差异表达miRNA的聚类热图

图5两组膝关节骨关节炎软骨细胞内差异显著的7个miRNA聚类热图

图6差异miRNA表达倍数

图7qRT-PCR验证miR-124-3p、miR-146a-5p及miR-126-3p变化趋势与基因芯片的结果相同

3.2miRNA在骨关节炎中差异性表达为骨关节炎发病机制和治疗干预提供新思路

随着miRNA在骨关节炎发病中的作用研究逐步深入，已发现一些在软骨分化过程中具有较强特异性的miRNA，早期研究认为骨关节炎患者关节软骨、滑膜、关节液内的miRNA均存在变化，并通过测序技术发现了多种miRNA表达异常，如miRNA-9、miRNA-140、miRNA-146、miRNA-223、miRNA-483等[16]。随着骨关节炎的发生，软骨表面因受到多种趋化因子激活而释放破坏软骨基质的酶类，KOSTOPOULOU等[17]及TARDIF等[18]认为miRNA的功能与这类酶有关，他们发现骨关节炎相关miRNA能对基质金属蛋白酶13产生抑制作用。基质金属蛋白酶13是骨关节炎中具有重要生物学作用的一类人体蛋白酶，它可降解软骨细胞外基质，破坏关节软骨，引发及加重骨关节炎。

早期发现软骨退变相关的非编码RNA是miR-146a-5p[19]。miR-146a可靶向作用于Camk2d和Ppp3r2，调控软骨平衡从而抑制软骨退变。HASEEB等[20]通过深度测序技术发现骨关节炎软骨细胞内miR-146a-5p表达显著差异，提示miR-146a-5p与骨关节炎发病具有密切关系。LI等[21]前期研究发现白细胞介素1β在骨关节炎软骨细胞内可刺激miR-146a表达上调，而miR-146a通过靶向抑制Smad4加速骨关节炎发展。YAMASAKI等[22]使用RT-PCR和原位杂交实验方法分析软骨中miRNA-146a表达情况，发现骨关节炎病变越重，miRNA-146a表达越低。另外也发现了随着病程进展，细胞因子及炎性细胞增多，抗炎症机制失衡，加快骨关节炎进展。ILIOPOULOS等[23]通过关节软骨损伤患者的miRNAs分析，发现16种miRNAs在软骨损伤患者中有差异表达。JONES等[24]发现骨关节炎患者部分miRNAs与正常人相比有差异表达。

该研究在培养人的骨关节炎软骨细胞内加入基质细胞衍生因子1与未加基质细胞衍生因子1对比，通过基因芯片筛选差异变化的miRNA有84个，证实了miRNA在骨关节炎中差异性表达。对变化显著的7个miRNA(miR-146a-5p、miR-124-3p、miR-130a-3p、miR-185-5p、miR-221-3p、miR-126-3p)进行RT-PCR实验验证，结果表明miR-146a-5p、miR-124-3p及miR-126-3p的qRT-PCR结果与基因芯片结果一致。基质细胞衍生因子1刺激骨关节炎软骨细胞后miRNA表达谱的变化，为基因层面延缓关节软骨退变提供实验基础。

参考文献：

[12]蒙旭晗.三种拮抗剂体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路调控关节软骨退变的研究[D].昆明:昆明医科大学,2018

[13]李龙滕,李彦林,王坤,等.TN14003体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路对骨关节炎患者软骨组织分泌基质金属蛋白酶3､9､13水平的影响[J].中国运动医学杂志,2017,36(1):44-47.

王国梁,李彦林,向耀宇,贾笛,李灿章,何璐.基质细胞衍生因子1诱导骨关节炎软骨细胞的miRNA表达谱分析[J].中国组织工程研究,2020,24(31):4948-4953.

基金:国家自然科学基金项目(81960409,81760403),项目负责人:李彦林;云南省自然科学基金重点项目[2017FE467(-007)],项目负责人:李彦林;云南省医学领军人才培养计划项目(L-201601),项目负责人:李彦林.