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克立硼对HaCaT细胞增殖的影响及其作用机制

2025-07-25 41 上传者：管理员

摘要：目的探究克立硼罗(Cri)对人类永生化表皮细胞HaCaT细胞增殖的影响及其作用机制。方法细胞计数检测试剂盒(CCK-8)筛选Cri对HaCaT作用质量浓度后，将HaCaT细胞随机分为对照组、模型组(10 ng/ml TNF-α处理)、Cri组(TNF-α+Cri处理)和激活剂组(TNF-α+Cri+NF-κB通路激活剂处理),对HaCaT细胞进行培养后，再次行CCK-8实验检测细胞活力，Western印迹法检测增殖蛋白(K16、K17)和NF-κB信号通路相关蛋白表达，2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)水平。结果 0.0、0.1、1.0μmol/L浓度Cri对HaCaT细胞存活率的影响差异无统计学意义(P>0.05),在10.0μmol/L浓度时，Cri对HaCaT细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05)。与对照组比较，模型组、Cri组和激活剂组HaCaT细胞存活率水平均上升，模型组和激活剂组增殖蛋白K16、K17蛋白表达、NF-κB通路蛋白NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达、细胞内ROS水平均上升，荧光强度增强，差异显著(P<0.05);而Cri组中HaCaT细胞存活率、蛋白K16、K17蛋白表达、NF-κB通路蛋白NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达、ROS水平相较于模型组明显下降(P<0.05),激活剂组中HaCaT细胞存活率、K16、K17蛋白表达、NF-κB通路蛋白NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达、ROS水平相较于Cri组明显上升(P<0.05)。结论 Cri能够降低TNF-α介导的HaCaT细胞增殖水平，抑制细胞增殖相关蛋白表达和氧化应激，其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。

关键词：
HaCaT细胞
克立硼罗
核转录因子(NF)-κB通路
活性氧
银屑病
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银屑病是由角质形成细胞异常增殖､分化引起的皮肤病,其以鳞屑､红斑为主要表现,其主要病理特征为角质形成细胞异常增殖分化和免疫异常〔1,2〕｡银屑病具有极为复杂的发病机制,其涉及多种细胞之间的相互作用及这些细胞分泌的多种细胞因子,促进炎症反应升级,进一步促进了角质形成细胞的增殖分化〔3,4〕｡角质形成细胞异常分化会导致银屑病斑块形成和脱落,破坏机体皮肤屏障,参与免疫紊乱的发生〔5,6〕｡因此,对角质形成细胞的过度增殖进行调节,是治疗银屑病的一个重要靶点｡目前针对银屑病的治疗主要为药物治疗和物理疗法等,其中药物治疗包括口服药､外用药等｡口服药物容易导致不良反应的产生,如恶心､腹泻等;外用药物能够减少因口服导致的胃肠道不良反应,但是部分患者在接受外用药物治疗后容易产生皮肤刺痛､发红等感受;而物理疗法会增加患癌风险〔7,8〕｡因此,寻求有效且安全的治疗药物对于银屑病患者的治疗有重要价值｡小分子靶向药具有效果稳定､不良反应少的优势,在银屑病药物研究中有极大潜力〔9〕｡目前对银屑病具有缓解效果的小分子靶向药物包括Janus激酶抑制剂和磷酸二酯酶(PDE)4抑制剂等,其通过靶向抑制相应的信号通路来抑制炎症反应的升级,增加抗炎因子的生成和释放,进一步减少免疫细胞的浸润〔10,11〕｡克立硼罗(Cri)软膏是一种磷酸二酯酶4抑制剂,其经临床试验明确对特异性皮炎有较好的治疗效果,对皮肤瘙痒等症状作用较好〔12〕｡另有研究明确Cri能够缓解银屑病症状,但是其作用机制尚不明确〔13,14〕｡因此本研究通过细胞实验探讨Cri对HaCaT细胞增殖的影响及其作用机制｡

1、材料与方法

1.1主要材料及仪器人类永生化表皮细胞HaCaT细胞株和对应培养基:上海中乔新舟生物｡Cri软膏:美国辉瑞;肿瘤坏死因子(TNF)⁃α:美国Peprotech公司;细胞计数检测试剂盒(CCK⁃8):武汉伊莱瑞特生物;电化学发光液和放射免疫沉淀(RI⁃PA)裂解液:碧云天生物;K16､K17抗体:美国CellSignaling公司;核转录因子(NF)⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65抗体:英国Abcam公司｡恒温培养箱:日本SANYO公司;电泳系统:北京六一;分光光度计:北京东西分析仪器;倒置显微镜:日本Olympus公司｡

1.2CCK⁃8实验筛选Cri作用质量浓度取HaCaT细胞接种于96孔板,接种密度为1×104个/孔,常温孵育24h后分别加入0.0､0.1､1.0､10.0μmol/LCri,培养24h后再加入10μlCCK⁃8溶液｡继续培养2h后,检测光密度(OD)值(450nm波长),分析细胞存活情况,筛选获得Cri作用质量浓度｡

1.3HaCaT细胞分组与处理HaCaT细胞采用相应培养基进行培养,培养条件为37℃,每3d视为细胞传代1次｡将细胞分为对照组､模型组(10ng/mlTNF⁃α处理)､Cri组(先行TNF⁃α处理,再加入1μmol/LCri处理1h)和激活剂组(在Cri组基础上添加0.9μmol/LNF⁃κB通路激活剂)｡

1.4CCK⁃8实验检测细胞活力将以上分组的HaCaT细胞进行CCK⁃8实验,实验步骤同1.2,计算细胞活力｡

1.5Western印迹法检测蛋白表达水平检测细胞增殖蛋白和NF⁃κB信号通路相关蛋白表达情况｡取各组HaCaT细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白,并经电泳将其转移至醋酸纤维膜,封闭2h后,分别滴加一抗(K16､K17､NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65､GAPDH),4℃过夜孵育后加入二抗孵育2h,采用电致化学发光显色后行蛋白条带分析｡

1.62,7⁃二氯荧光素二乙酸酯(DCFH⁃DA)荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)水平将HaCaT细胞接种于6孔板干预24h,然后采用DCFH⁃DA工作液避光孵育20min,以缓冲液对细胞进行冲洗,再用染色液对细胞核进行标记染色,使用荧光倒置显微镜进行观察､记录｡

1.7统计学处理采用SPSS20.0软件进行独立样本t检验｡

2、结果

2.1Cri对HaCaT细胞活性的影响采用CCK⁃8法检测发现,0.0､0.1､1.0μmol/L浓度Cri处理后HaCaT细胞存活率分别为(100.00±0.00)%､(98.13±7.12)%､(95.03±8.17)%,3组HaCaT细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05),在10.0μmol/L浓度时,HaCaT细胞存活率为(82.36±9.46)%,与其他3组细胞存活率差异具有统计学意义(P<0.05),提示10.0μmol/L浓度的Cri对HaCaT细胞增殖有抑制作用｡故后续研究均采用10.0μmol/L浓度Cri进行｡

2.2Cri和NF⁃κB通路激活剂对HaCaT细胞活性的影响与对照组比较,模型组､Cri组和激活剂组HaCaT细胞存活率均明显上升(P<0.05);而Cri组中HaCaT细胞存活率相较于模型组明显下降(P<0.05),激活剂组中HaCaT细胞存活率相较于Cri组明显上升(P<0.05)｡见表1｡

2.3Cri和NF⁃κB通路激活剂对HaCaT细胞增殖蛋白K16､K17表达的影响与对照组比较,模型组和激活剂组HaCaT细胞增殖蛋白K16､K17表达均明显上升(P<0.05);而Cri组K16､K17表达水平相较于模型组明显下降(P<0.05),激活剂组中HaCaT细胞K16､K17表达水平相较于Cri组明显上升(P<0.05)｡见表1｡

2.4Cri和NF⁃κB通路激活剂对HaCaT细胞ROS水平及NF⁃κB通路蛋白的影响与对照组比较,模型组､Cri组和激活剂组荧光强度增强,细胞内ROS水平明显上升(P<0.05);与对照组比较,模型组和激活剂组NF⁃κB通路蛋白NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65蛋白表达均明显上升(P<0.05);Cri组ROS水平及NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65蛋白表达相较于模型组明显下降(P<0.05),激活剂组ROS水平及NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65蛋白表达相较于Cri组明显上升(P<0.05)｡见表1｡

表1各组HaCaT细胞存活率､增殖蛋白K16､K17表达､ROS水平及增殖蛋白NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65表达比较(x±s,n=10)

3、讨论

本研究提示,TNF⁃α能够介导HaCaT细胞的异常增殖,K16､K17表达上调提示了HaCaT细胞的高度活化,表明细胞模型建立成功｡当皮肤损伤时,K16､K17蛋白的表达上调,而K17又能促进机体炎症反应,促进角质形成细胞的过度增殖,进一步推动银屑病进程〔15,16〕;Cri能够抑制HaCaT细胞的过度增殖,降低其增殖相关蛋白如K16､K17表达水平,提示HaCaT细胞可能为Cri的作用靶细胞,Cri在银屑病的治疗中具有较强的潜力｡桂雨晴等〔17〕也证实了Cri能够调节角质形成细胞的异常增殖｡

ROS是线粒体发挥正常功能时产生的物质,其能介导细胞反应,活化免疫细胞,但是不平衡的ROS产生与代谢会导致自由基的形成和氧化应激的发生,进而导致多种炎症疾病的发生〔18〕｡有研究显示,ROS水平异常升高会导致多条信号通路被激活,如NF⁃κB信号通路等,再经信号通路激活下游促炎基因的表达〔19〕｡另有研究显示,消除银屑病患者机体中的过量ROS对于降低炎症介质的表达,改善患者炎症症状有重要价值〔20〕｡本研究提示,Cri对抑制HaCaT细胞的氧化应激有一定作用｡NF⁃κB是一种重要的生物因子,其在免疫应答和炎症反应中均有重要调节作用｡有研究显示,NF⁃κB能参与银屑病的发病过程,其主要表现为NF⁃κB信号被激活,而磷酸化NF⁃κB水平上升〔21〕｡因此认为对NF⁃κB信号通路进行抑制,能降低HaCaT的增殖活化水平,减弱炎症反应的剧烈程度｡本研究提示,TNF⁃α处理HaCaT细胞能够激活NF⁃κB信号通路,促进NF⁃κBp65磷酸化,以此模拟HaCaT细胞损伤状态;对处理过的HaCaT细胞加用Cri后,细胞NF⁃κBp65､p⁃NF⁃κBp65表达水平降低,提示Cri能够阻断NF⁃κB信号通路,以此抑制HaCaT细胞的增殖,这可能为Cri缓解银屑病患者症状的机制;研究最后对Cri处理过的HaCaT细胞加用NF⁃κB通路激活剂,结果发现,添加NF⁃κB通路激活剂后,NF⁃κB信号通路被激活,NF⁃κB相关蛋白表达水平上升,且细胞增殖水平相较于未添加通路激活剂的细胞也有大幅提升,细胞ROS水平也随之上升,提示NF⁃κB通路激活剂逆转了Cri对HaCaT细胞的增殖抑制作用,反面证实了Cri对HaCaT细胞增殖抑制作用是通过阻断NF⁃κB信号通路达成的｡

综上所述,Cri能够降低TNF⁃α介导的HaCaT细胞增殖水平,抑制细胞增殖相关蛋白表达和氧化应激,其机制可能与抑制NF⁃κB信号通路有关,这为Cri在银屑病症状缓解提供了理论依据｡

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