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朗格汉斯细胞及T淋巴细胞亚群的分析

2020-10-19 558 上传者：管理员

摘要：目的研究女阴硬化性苔癣皮损中朗格汉斯细胞、T淋巴细胞亚群的变化。方法采用直接免疫荧光的方法检测7例LS初期病例和8例LS后期病例表皮朗格汉斯细胞密度,真皮CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞密度,并与15例正常女性外阴皮肤进行对比。结果LS后期病例表皮朗格汉斯细胞密度较正常组有明显增加(P=0.001)。LS初期病例和后期病例(真皮中下层)真皮CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度均较正常组增加(P均<0.05),初期病例CD4+/CD8+T细胞比值与正常组差异无统计学意义(P=0.151);LS后期病例(真皮中下层)的CD4+/CD8+T细胞比值低于LS初期组、LS后期组(真皮浅层)及正常组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论随LS病情进展,表皮朗格汉斯细胞密度、真皮CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度以及CD4+/CD8+T细胞比值呈动态变化,说明细胞免疫在LS发病机制中起重要作用。

关键词：
T淋巴细胞
免疫学
动态变化
发病机制
朗格汉斯细胞
皮肤病
硬化性苔藓
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硬化性苔藓是一种好发于女性外阴部位的慢性炎症性疾病,其发病机制尚不明确,与自身免疫、遗传、慢性刺激、感染等多种因素相关。目前发现LS存在局部细胞免疫异常,主要表现为LS表皮朗格汉斯细胞数目异常[1,2,3]、真皮T淋巴细胞数目异常[1,4,5]以及多种细胞因子[6,7,8]表达异常。表皮内的朗格汉斯细胞具有抗原提呈并诱发迟发型变态反应的功能,在皮肤免疫机制中起着重要作用。真皮中存在大量T淋巴细胞,不同亚群T细胞数目的变化可反映局部组织的免疫状态。因此本研究从组织病理学角度检测不同时期女性外阴LS患者表皮内朗格汉斯细胞和真皮内T细胞亚群等的变化,以揭示本病发病过程中细胞学的变化情况,推测免疫学机制在外阴LS病变中的作用。

1、对象与方法

1.1对象

1.1.1LS病例组

来自2018年6-12月于北京医院皮肤科诊治的成年女性外阴LS患者,经临床诊断(图1)及组织病理学检查确诊。根据HE染色下病理表现分为初期病例7例和后期病例8例。

1.1.2分组标准

初期皮损可见棘层轻度不规则增厚,真皮浅层水肿,但尚无明显的均质带形成,大量淋巴细胞浸润,淋巴细胞接近表皮;后期皮损可见表皮角化过度,棘层细胞减少,基底细胞液化变性,真皮浅层胶原纤维变性形成均质带,其下方大量的淋巴细胞呈苔藓样浸润(图2)。

图1不同时期LS皮损临床图像

图2不同时期LS皮损组织病理学图像(HE×40)

1.1.3正常对照组

来自2019年1-6月于中国医学科学院整形外科医院行外阴整形手术的成年女性患者,共纳入15例,所有标本经组织病理学检查证实为正常皮肤组织。

1.2方法

1.2.1试剂

一抗为朗格素(Langerin)兔源单抗,由美国Abcam公司生产,稀释度1∶500;CD3小鼠源单抗、CD4小鼠源单抗、CD8小鼠源单抗,均由美国BDHorizon公司生产,稀释度1∶300。二抗为AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)、AlexaFluor488驴抗兔IgG(H+L),均由美国ThermoFisher公司生产,稀释度1∶500。冷冻切片包埋剂:Tissue-Tek。*CRYO-OCTCompound,由美国Sakura公司生产;ABC免疫组化试剂盒:VECTASTAINEliteABCKit(Standard*),由美国Vectorlabs公司生产;酪胺信号放大试剂盒:AlexaFluorTM488TyramideSuperBoostTMKit,由美国ThermoFisher公司生产。

1.2.2免疫荧光染色

OCT包埋标本,-80℃液氮冷冻,16μm冰冻切片,2.4%多聚甲醛溶液固定标本,0.3%H2O2-甲醇溶液透膜处理,封闭液封闭,加入Langerin兔源单抗、CD3、CD4或CD8小鼠源单抗,4℃下孵育8～24h,PBS缓冲液清洗3次,每次15min,加入AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)或AlexaFluor488驴抗兔IgG(H+L),4℃下孵育2h,ABC法染色30min,酪胺信号放大10min,DAPI染色30min,50%甘油-DAPI溶液封片,-20℃条件保存。

1.2.3图片处理

免疫荧光染色图像使用Zeiss-M1正置荧光显微镜(Zeiss公司,德国)拍摄,每个切片选择3个视野。使用Imarisx647.4软件(Bitplane公司,瑞士)和ZENblueedition2012软件(Zeiss公司,德国)进行图像处理。计算表皮内朗格汉斯细胞密度;真皮内CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞密度,LS初期组和正常对照组计算真皮全层各亚群T细胞密度,LS后期组分别计算真皮浅层均质带(以下简称真皮浅层)和真皮中下层炎症浸润带(以下简称真皮中下层)各亚群T细胞密度。

1.3统计学分析

应用SPSSStatistics20.0软件进行统计学分析,符合正态分布的计量资料采用x¯±s表示。各组别数值先进行方差齐性检验,经检验各组表皮朗格汉斯细胞密度、真皮CD4+/CD8+T细胞比值的数据方差相等,故使用单因素方差分析比较多组之间的差异性,之后采用LSD-t检验进行组间两两比较;各组平均年龄、真皮CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度的数据方差不齐,故使用Welch′sanova方法比较多组之间的差异性,之后采用Games-Howell检验进行组间两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1年龄

LS初期组平均年龄为(39.71±14.33)岁(22～57岁),LS后期组平均年龄为(35.25±11.20)岁(22～53岁),正常对照组平均年龄为(30.40±8.14)岁(19～47岁)。三组之间年龄差异无统计学意义(F=1.54,P>0.05)。

2.2表皮朗格汉斯细胞密度

Langerin标记朗格汉斯细胞,根据荧光信号可见朗格汉斯细胞分布在表皮内(图3a～3c)。经图像处理及计算,LS初期组、LS后期组及正常对照组表皮朗格汉斯细胞的平均密度见表1,图4a。LS后期组表皮朗格汉斯细胞密度略高于初期组,初期组略高于正常组,但两两比较差异均无统计学意义(t=1.63,1.64;P<0.05);而LS后期组高于正常组,二者差异有统计学意义(t=3.64,P=0.001)。

2.3真皮CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度

CD3、CD4、CD8单抗分别标记CD3+、CD4+、CD8+T细胞,根据荧光信号可见CD3+、CD4+、CD8+T细胞分布在真皮内(图3d～3l)。LS初期组、LS后期组(真皮浅层和真皮中下层)及正常对照组真皮CD3+T细胞的平均密度见表1,图4b～4d。其中CD3+、CD8+T细胞密度由高至低依次为:LS后期组(真皮中下层)>LS初期组>正常组>LS后期组(真皮浅层),经两两比较各组间差异均有统计学意义(t=3.72,4.45,3.46,3.80,3.58,3.57;P均<0.05)。CD4+T细胞密度由高至低依次为:LS后期组(真皮中下层)>LS初期组>正常组>LS后期组(真皮浅层),经两两比较,LS后期组(真皮中下层)略高于LS初期组,差异无统计学意义(t=1.45,P=0.492)外,这两组均高于正常组,差异均有统计学意义(t=4.28,3.40;P<0.05);而LS后期组(真皮浅层)低于正常组,差异有统计学意义(t=4.21,P=0.005)。

2.4真皮CD4+/CD8+T细胞比值

LS初期组、LS后期组(真皮浅层和真皮中下层)及正常对照组真皮CD4+/CD8+T细胞比值见表1、图4e。其中LS后期组(真皮中下层)的CD4+/CD8+T细胞比值低于LS初期组、LS后期组(真皮浅层)及正常组,差异均有统计学意义(t=2.47,2.77,4.45;P<0.05)。在后三组中,LS初期组略低于LS后期组(真皮浅层),LS后期组(真皮浅层)略低于正常组,LS初期组略低于正常组,但差异均无统计学意义(t=0.21,1.29,1.47;P>0.05)。

表1各组间朗格汉斯细胞密度、CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度及CD4+/CD8+T细胞比值的比较

图3表皮朗格汉斯细胞、真皮CD3+、CD4+及CD8+T细胞表达的荧光图像(10×10倍)

图4各组表皮朗格汉斯细胞((4a))、真皮CD3+((4b))、CD4+((4c))、CD8+((4d))T细胞密度及CD4+/CD8+T细胞比值()的比较

3、讨论

目前关于免疫因素在LS病因学方面的作用主要集中在对其皮损中T淋巴细胞和细胞因子变化的研究上,也有少量文献报道了LS朗格汉斯细胞的变化。本研究通过直接免疫荧光的方法检测并分析了LS中朗格汉斯细胞、T淋巴细胞亚群的变化,探究LS发病中的一些细胞学变化,以期为其发病机制的研究提供基础。

朗格汉斯细胞多数分布于表皮内,主要通过E-钙黏素与角质形成细胞连接[9],是皮肤的抗原提呈细胞。有许多研究表明朗格汉斯细胞与T淋巴细胞介导的炎症性皮肤病有关,如斑秃[10]、白癜风[9]、扁平苔藓[11]等,但在LS中的研究非常少。目前认为,LS中淋巴细胞在真皮内的聚集可能与表皮内朗格汉斯细胞增多有关。一方面朗格汉斯细胞可能通过抗原提呈作用使T淋巴细胞增殖和激活;另外,也有研究发现,朗格汉斯细胞和淋巴细胞可以通过可溶性分子和膜分子直接进行接触,使这两种细胞相互激活[12]。本研究发现LS初期表皮内朗格汉斯细胞的密度与正常人相比增多不明显;而后期病例中,LS表皮内朗格汉斯细胞明显增多,同时真皮内的淋巴细胞也出现致密的苔藓样浸润,因此推测两者可能相互促进活化和增殖,在LS病情进展中共同介导炎症反应。

如同许多其他炎症性皮肤病一样,淋巴细胞在皮肤组织中的聚集在LS的发病过程中起着重要的作用。国内外大多数研究认为,不同时期的LS皮损中T淋巴细胞的亚型和数目呈动态变化[1,13,14]。病程初期浸润的淋巴细胞以CD4+T细胞为主,随疾病进展,CD8+T细胞比例逐渐上升,且产生细胞毒性颗粒蛋白如T细胞限制性细胞内抗原-1(TIA-1)和颗粒酶B蛋白(GrB)的T细胞也逐渐增多,而这些是导致LS基底细胞液化变性的重要原因之一[7];基底细胞的破坏会影响角质形成细胞的正常增殖,可能导致表皮厚度的变化。另外,CD8+T细胞的增多可使γ干扰素表达增加,诱导细胞毒性反应,促使黑素细胞损伤、凋亡,这在一定程度上可能与白癜风的发病机制相似,在临床上出现色素减退的表现。本研究对比了LS初期病例、LS后期病例和正常女性外阴的真皮内T淋巴细胞的密度,发现无论在LS的初期还是后期,真皮内浸润的T淋巴细胞密度均高于正常对照组,且后期密度更高。而LS初期真皮CD4+/CD8+T细胞比值和正常对照组接近,约为2∶1;在LS后期,真皮中下层炎症细胞浸润带内CD8+T细胞则显著增多,CD4+/CD8+T细胞比值下降至0.7∶1,即在LS病情进展的过程中,CD8+T细胞的数量增长更加迅速,说明CD8+T细胞介导的细胞毒性免疫反应可能在LS疾病的发生及病情进展中具有重要作用。此外,T淋巴细胞还可能通过释放多种细胞因子,如肿瘤坏死因子α、白介素1a、细胞间黏附分子-1等,影响表皮角质形成细胞和黑素细胞的增殖以及真皮胶原的合成,进而导致LS出现表皮萎缩、色素减退及胶原纤维变性均质化等病理表现,这些机制还有待进一步研究。

参考文献：

[4]刘阳,马涛,武昕.CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润与外阴上皮内非瘤样病变的相关性[J].中国医科大学学报,2010,39(7):561-563.

[5]王婧,武昕.CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD57+NK细胞和Vimentin在外阴硬化性苔藓中表达及临床意义[J].中国妇幼保健,2015,30(16):2651-2654.

[9]张继玲,曹碧兰,袁伟,等.白癜风患者皮损中CD4+,CD8+T淋巴细胞及朗格汉斯细胞的检测[J].中国皮肤性病学杂志,2008,22(11):649-651.

[10]张小婷,李水凤,赵莹,等.斑秃皮损内朗格汉斯细胞及CD8+T细胞的数量及分布分析[J].中华皮肤科杂志,2014,47(1):33-37.

刘琬,李子媛,孙凯律,杨敏,傅裕,常建民.女阴硬化性苔藓皮损中朗格汉斯细胞及T淋巴细胞亚群的分析[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(10):1110-1115.

基金:中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2018-I2M-1-002).