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基于网络药理学和分子对接探讨肤疾洗剂治疗瘙痒症分子机制

2023-11-29 82 上传者：管理员

摘要：目的采用网络药理学和分子对接方法探究肤疾洗剂治疗皮肤瘙痒症的活性成分、关键作用靶点及潜在的分子机制。方法运用TCMSP、Swiss Target Prediction、GeneCards数据库及文献报道对肤疾洗剂中活性成分、作用靶点及疾病靶点进行检索，Cytoscape软件进行成分–靶点网络图构建，通过DAVID数据库，进行基因本体（GO）功能分析与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，最后通过分子对接预测活性成分与靶点蛋白的结合能力。结果获得肤疾洗剂61种有效成分和1 049个作用靶点，瘙痒症疾病靶点1 621个，其中肤疾洗剂146条信号通路，主要富集在癌症通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)等。分子对接结果显示核心成分与关键靶点具有较好的结合活性。结论肤疾洗剂具有抑制炎症、免疫调控作用，其发挥作用的主要活性成分为生物碱类、柠檬苦素类和黄酮类等，涉及的主要靶点有蛋白激酶1(Akt1)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、黏着连接蛋白β1(CTNNB1)、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）等，符合中药复方多成分、多靶点、多途径的特点，为后续研究提供参考。

关键词：
分子对接
分子机制
柠檬苦素
生物碱
瘙痒症
网络药理学
肤疾洗剂
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瘙痒症是目前临床上较常见的一种无原发性皮损的疾病，其发病机制较为复杂，皮肤的主要表现是出现严重的瘙痒感，因此患者会长期反复搔抓致使皮肤出现红肿、破损，严重者则会导致溃烂感染[1]。在长期感受瘙痒感后，患者会产生烦躁、焦虑等负性情绪，对患者的生活质量造成严重影响[2]。瘙痒症发病机制可能与皮肤较为干燥有关，生活习惯、精神状态以及居住环境等因素也与发病有着一定的关联性[3]。临床治疗瘙痒症目前主要是着眼于对引发瘙痒疾病因素的治疗和对皮肤的干预，瘙痒的局部治疗药物包括糖皮质激素、局麻药、抗组胺药物等，但均存在一定的潜在不良反应，同时部分患者在使用过程中存在药物禁忌[4]。胆汁淤积性瘙痒等不依赖组胺介导的瘙痒症不能被临床传统的药物缓解或治愈[5]。中药肝肾毒性较低且经皮吸收能够避免肝脏首过效应及胃肠道刺激，同时可以调节机体免疫、改善体质，疗效较高且不良反应较低，是临床上重要的给药方式[6]。中药洗剂被认为是治疗皮肤瘙痒症的新思路、新方法、新方向。

肤疾洗剂由苦参、百部、花椒、白鲜皮、硼砂、雄黄6味中药组方，具有解毒杀虫、止痒收敛、活血祛瘀的功效，其中苦参清热燥湿、杀虫止痒；百部杀虫灭虱；白鲜皮清热燥湿、祛风解毒；花椒杀虫止痒；雄黄解毒杀虫。硼砂清热解毒、解毒防腐，但由于硼砂属于矿物药，在系统里没有靶点，故后续内容不再涉及。中医理论将皮肤瘙痒症分为风痒、湿痒和热痒、虫毒致痒等分型，肤疾洗剂组方符合皮肤瘙痒证病机，能够抑制局部皮肤致病菌群定殖，但其作用的分子机制目前尚未清晰。网络药理学能够揭示中药复方多成分、多靶点、多途径作用的机制，有助于丰富中药复方肤疾洗剂的科学内涵[7]。本研究通过网络药理学联合分子对接技术，以肤疾洗剂经皮吸收多成分多靶点为切入点，揭示肤疾洗剂治疗皮肤瘙痒症的作用靶点和通路，为其进一步深入研究与临床应用提供参考和理论依据。

1、资料与方法

1.1肤疾洗剂的活性成分及靶点收集

利用中医系统药理学数据库（TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行查询。基于经皮给药系统药物的特点，一般认为经皮吸收活性成分属性值的筛选条件以类药性（DL）≥0.18、Alg P>5、相对分子质量≤500为临界值[8,9,10]。以肤疾洗剂组方能够抑制皮肤致病菌群定殖为特点，筛选苦参、百部、花椒、白鲜皮4味中药的活性成分，将筛选出的成分导入Swiss Target Prediction数据库（http://swisstarget prediction.ch/），以possibility>0为筛选条件，获得药物相关靶点，以BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获取雄黄作用靶点。

1.2疾病靶点及交集靶点的获取

在Gene Cards(https://www.genecards.org）中，以“pruritus”和“itching”为检索词，收集相关性值大于平均值的靶点作为疾病靶点。在Venny 2.1.0制图平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制瘙痒症与肤疾洗剂的交集靶点。

1.3蛋白相互作用（PPI）网络构建

为了进一步更好理解中药、成分与其相应靶点之间的相互作用关系，选择degree值高的靶点导入至Cytoscape 3.7.1软件，模式设置为“多种蛋白”，物种限定为“Homo sapiens”。构建PPI网络图，进行可视化分析。

1.4基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将交集靶点的official gene symbol输入DAVID数据库（https://DAVID.ncifcrf.gov/），Select Identifier选择“official gene symbol”，物种选择“homo sapiens”，对作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO和KEGG富集分析气泡图。

1.5成分–靶点–通路网络构建与分析

为了进一步更好理解中药、成分与其相应靶点之间的相互作用关系，根据富集的KEGG通路及作用靶点，构建成分–靶点–通路网络图。选择degree值高的成分作为主要活性成分，将活性成分、靶点、通路经Excel处理后，导入至Cytoscape 3.7.1软件，构建成分–靶点–通路网络图，进行可视化分析。

1.6分子对接

选择核心活性成分和核心靶点进行分子对接验证利用RCSB PDB(https://www.RCSB PDBus.org/），Pub Chem数据库及Autodocktool 1.5.6软件获取分子对接所需相关文件格式。借助Autodocking vina1.2.0分子对接。选取结合自由能小的构象用Pymol进行可视化及结果分析。选择degree>2的化合物进行对接。

2、结果

2.1肤疾洗剂活性成分、靶点筛选

筛选到61个化合物（表1），药物靶点1 049个，检索Gene Cards数据库得到疾病靶点1 621个。经过用Venn 2.1.0得到213个肤疾洗剂与瘙痒症的交集靶点（图1），这213个交集靶点为肤疾洗剂治疗瘙痒症的潜在靶点。

2.2肤疾洗剂–瘙痒症靶点PPI网络

根据肤疾洗剂–瘙痒症共有的靶标逆向筛选中药复方活性成分，删除重复项共获得活性成分149个，将213个肤疾洗剂与瘙痒症交集靶点输入STRING平台，构建PPI网络（图2），共获得146个节点和1 722条节点之间的连线。

表1肤疾洗剂药效成分

图1肤疾洗剂与瘙痒症靶点Venn图

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库的Functional Annotation功能对上述核心靶点进行了GO富集分析，得到生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）共801条GO条目（P<0.01）。其中BP相关条目603条，包括炎症反应（inflammatory response）、胞浆钙离子浓度的正调控（positive regulation of cytosolic calcium ion concentration）。MF相关条目122条，包括蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等。CC相关条目76条，包括质膜（plasma membrane）、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）等。根据lg P值升序排列选取前30条绘制图3。

图2 PPI网络图

利用KOBAS 3.0在线工具对通路富集分析中得到146条信号通路（P<0.01），选取前30条绘制，见图3，包括癌症通路、肿瘤坏死因子（TNF）、低氧诱导因子-1(HIF-1）等信号通路。

图3 GO功能和KEGG通路富集分析气泡图

2.4“成分–靶点–通路”网络

通过Cytoscape 3.7.2可视化“成分–靶点–通路”网络（图4），包含97个节点和234个连接。椭圆节点表示靶点，菱形节点表示活性成分，菱形节点表示通路，灰色线表示节点间相互作用。

2.5分子对接

对接分数值小于-4.25 kcal/mol(1 cal=4.4 J）表示两者间有一定的结合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有强烈的结合活性[11]。分子对接结果显示，原百部碱、黄柏内酯、大豆素、百部生物碱、异原百部碱等化学成分与表皮生长因子受体（EGFR）、CXC趋化因子配体8(CXCL8）、Toll样受体4(TLR4）等靶点对接结合能均<-7.0 kcal/mol，说明蛋白与分子之间能稳定的结合。异原百部碱与CXCL8在ARG-26、GLN-8处形成氢键，黄柏内酯与CXCL8在ARG-26、LYS-42、TYR-13处形成氢键。原百部碱与CXCL8在LEU-51、ARG-26处形成氢键。大豆素与EGFR在ARG-269处形成氢键，异原百部碱与EGFR在ARG-161、ARG-62、CYS-145、TYR-144处形成氢键。黄柏内酯与EGFR在HIS-235处形成氢键。原百部碱与EGFR在TYR-261、ASN-316、TYR-309处形成氢键。大豆素与TLR4在GLN-578、AGR-606处形成氢键。大豆素与TLR4在GLN-578、AGR-606处形成氢键。百部生物碱与TLR4在MET-618处形成氢键，见图5。将对接的数据采用热图进行分析，见图6，结合能的绝对值越大，结合作用越强。

图4成分–靶点通路图

图5活性成分–关键靶点分子对接图

图6肤疾洗剂活性成分与靶点相互作用的分子对接分数热图

3、讨论

中医理论认为瘙痒症的主要发病机制与湿热内蕴、虫毒所致有关，肤疾洗剂具有解毒杀虫、止痒收敛、活血祛瘀功效。本研究筛选得到该方具有潜在生物活性的61个化合物，并对213个潜在靶点进行功能富集分析，揭示这些靶点与炎症和免疫相关的生物学过程密切相关。进一步构建了分子基因网络、拓扑网络、通路与基因网络，分析结果提示肤疾洗剂通过多成分、多途径协同作用，以免疫调节和抗炎作用共同实现对瘙痒症的治疗作用。

通过网络药理学研究揭示了肤疾洗剂的活性成分有百部碱、黄柏内酯、大豆素、百部生物碱、异原百部碱等。通过PPI网络和活性成分–靶点–通路网络图，筛选出肤疾洗剂抗炎、免疫调控作用的共同核心靶点为蛋白激酶B1(Akt1）、CXCL8、CTNNB1、EGFR、TNF等。其中Akt1是一种关键的调节激酶，是PI3K/Akt信号转导通路上的主要因子，在信号通路中起到承上启下的作用，是PI3K控制细胞增殖、存活和细胞周期的主要下游靶蛋白，磷酸化的Akt1还可调控下游因子介导炎性反应[12]。Akt参与机体的炎症反应、调节机体的免疫应答，也有研究表明，Akt磷酸化的激活可以抑制炎症因子的表达和分泌，从而表现抗炎作用[13,14]。

GO富集中生物过程主要涉及到炎症反应、ERK1和ERK2的正向调节、胞浆钙离子浓度的正调控、MAPK级联的正调控等方面。KEGG富集结果显示其作用通路可能是pathways in cancer、TNF、HIF-1等。PPI网络分析结果显示，肤疾洗剂的活性成分主要作用于Akt1、VEGFA、TNF、CTNNB1、EGFR、TLR4、CXCL8等靶点发挥治疗瘙痒症作用。

分子对接结果显示，原百部碱、黄柏内酯、大豆素、百部生物碱、异原百部碱等化学成分与EGFR、CXCL8、TLR4等靶点有较好的结合活性。有研究表明黄柏内酯通过抗炎发挥治疗作用，对炎性因子的表达有直接抑制作用[15,16,17]。此外，百部生物碱、原百部碱能与EGFR、CXCL8、TLR4等靶点较好结合，有研究表明百部煎液或浸液中生物碱类成分对多种致病菌及皮肤真菌有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、变形杆菌、白喉杆菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌等均有不同程度的抗菌作用[18,19]。

综上所述，本研究利用网络药理学与分子对接技术对肤疾洗剂的主要活性成分及其治疗瘙痒症的作用机制进行了初步的筛选和分析，为进一步深入研究肤疾洗剂发挥药效作用的物质基础及作用机制提供了思路和方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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