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血小板聚集率对产后下肢深静脉血栓形成的预测价值及其可能机制

2020-09-22 137 上传者：管理员

摘要：目的探究血小板聚集率对产后下肢深静脉血栓形成的预测价值及其可能机制。方法选取2017年7月-2019年6月该院产科收治的产后下肢深静脉血栓患者24例(研究组)，另选择同期分娩的正常孕妇26例作为对照组。采用血细胞计数器计数血小板，采用ELISA试剂盒测定患者血小板糖蛋白(GPIb)和血小板活化因子(PAF)含量，采用流式细胞术测量血小板膜血小板P-选择素(CD62p)和溶酶体膜糖蛋白(CD63)阳性率，采用WesternBlot法测定血小板中PI3K和AKt磷酸化蛋白表达水平。结果与对照组比较，研究组患者剖宫产率和5min最大血小板聚集率显著升高(P<0.05),PAF、CD62p、CD63三种血小板活性指标显著升高(P<0.05)，血小板中PI3Kp110β和P-AKt蛋白表达水平显著升高。血小板聚集率预测产后深静脉血栓形成的ROC曲线下面积为0.797(P<0.05,95%CI:0.672～0.923)。Pearson相关性分析结果显示，血小板聚集率与PAF、CD62p、CD63三种血小板活性指标及血小板中的PI3K、P-AKt水平呈显著正相关(P<0.05)。结论产后深静脉血栓形成患者的血小板聚集活性显著升高，对产后下肢深静脉血栓的形成具有一定的预测价值。此外，PI3K/AKt信号通路激活可能是血小板聚集的机制之一。

关键词：
PI3K/Akt信号通路
剖宫产
深静脉血栓
血小板活性
血小板聚集率
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深静脉血栓形成是产后常见的并发症之一[1]。母体血液成分、血液细胞活动变化加剧引起血液高凝状态，妊娠子宫压迫、产后卧床休息和坐位母乳喂养引起的深静脉血流缓慢，加上产妇创伤激活凝血，使得产妇成为深静脉血栓形成的高危人群[2]。加强对下肢深静脉血栓形成规律及发病机制的研究，有助于下肢深静脉血栓形成的早期识别[3]。血小板聚集是血栓形成的重要部分[4]，研究[5]表明，PI3K/AKt信号通路可参与血小板粘附和聚集活性的调节。然而，产后深静脉血栓形成患者的血小板聚集率和PI3K/AKt信号通路的变化需要进一步确定[6]。本研究通过对深静脉血栓形成患者的血小板聚集率、血小板活性指标、PI3K表达水平以及AKt磷酸化的变化，探讨产后深静脉血栓形成的血小板聚集活性变化及其可能机制，旨在为产后下肢深静脉血栓形成患者的早期诊断提供理论依据。现将结果报道如下。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2017年7月-2019年6月山东省妇幼保健院产科收治的产后下肢深静脉血栓患者24例作为研究组，平均年龄(28.67±7.25)岁。另选择同期分娩的正常孕妇26例作为对照组，平均年龄(27.35±6.84)岁。纳入标准:(1)下肢肿胀、疼痛、浅静脉曲张和深静脉血栓形成的其他临床表现;(2)通过超声诊断的深静脉血栓形成。排除标准:(1)妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、胎盘早剥和其他妊娠障碍的患者;(2)有严重心脏、肝和肾功能障碍或严重感染的患者;(3)与免疫系统疾病或活动性出血和其他疾病相关的患者。两组患者之间年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1血液样本的收集与处理

收集患者产后1～2周静脉血样。将收集的静脉血在4℃下以1500g离心30min，取血浆，用于测定血小板糖蛋白(GPIb)和血小板活化因子(PAF)含量。将样品在4℃以700g离心10min获得上部血浆，制备富含血小板的血浆(PRP)，然后在4℃下以700g离心15min以抽取上部血浆，制备贫血小板血浆(PPP)，并使用血细胞计数器计数血小板。用PRP调节PPP至血小板浓度为3×108个细胞/ml，并通过冷冻保存储存。将调整后的PRP置于四通道血小板聚集仪中以确定5min最大血小板聚集率。

1.2.2血小板活性指标的测定

采用ELISA试剂盒测定患者GPIb和PAF含量。流式细胞术用于测量血小板膜血小板P-选择素(CD62p)和溶酶体膜糖蛋白(CD63)阳性率。调节PRP后，加入1%多聚甲醛，在室温下固定15min，用PBS-EDTA溶液洗涤两次，离心，取上清液。然后，加入CD62p-FITC和CD63-FITC，通过吹气混合，在室温下避光反应30min，洗涤两次，并悬浮在PBS溶液中，然后进行流式细胞术检测。选择490nm的激发波长，调节角电压，分割靶血小板群，计算CD62p和CD63的阳性率。

1.2.3血小板中PI3K和AKt磷酸化水平测定

将调整后的PRP加入裂解液中以裂解血小板，使用BCA方法测量蛋白质浓度，将样品在凝胶上运行，转移到膜上，用牛奶封闭，并与原代兔抗人AKt多克隆抗体(1∶600)，磷酸化AKt多克隆抗体(1∶1000),PI3Kp110β单克隆抗体(1∶1000)和β-actin单克隆抗体(1∶1000)孵育，然后将其与山羊抗兔多克隆二抗(1∶1500)一起温育。最后，添加ECL发光显影剂，曝光并成像。

1.3统计学分析

采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料数据以(±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验;计量资料数据以[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析进行相关性分析，采用ROC曲线评估血小板聚集率在预测产后下肢深静脉血栓形成中的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组间一般资料和血小板聚集率比较

与对照组比较，研究组患者剖宫产率和5min最大血小板聚集率显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2血小板聚集在预测产后下肢深静脉血栓形成中的价值

根据5min最大血小板聚集率的ROC曲线，预测产后深静脉血栓形成的发生率(见图1)。ROC曲线下面积(AUC)为0.797(P<0.05,95%CI:0.672～0.923)。

2.3血小板活性指标变化及其与血小板聚集率的相关性分析

与对照组比较，研究组患者PAF、CD62p、CD63三种血小板活性指标显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。Pearson相关性分析结果显示，PAF、CD62p、CD63三种血小板活性指标与血小板聚集率呈显著正相关(r=0.387、0.452、0.453,P=0.005、0.001、0.001)。

表1两组间一般资料和血小板聚集率比较[±s，例(%)]

图1血小板聚集率预测产后下肢深静脉血栓形成的ROC曲线图

2.4血小板中PI3K和AKt表达的变化及其与血小板聚集率的相关性分析

与对照组比较，研究组患者血小板中PI3Kp110β和P-AKt蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图2。研究组患者血小板聚集率与血小板中的PI3K、P-AKt水平呈显著正相关(r=0.442,P=0.001;r=0.431,P=0.002)，血小板聚集率与血小板中PI3K表达和AKt磷酸化水平的相关性见图3。

表2两组间血小板活性指标比较(±s)

图2血小板中PI3K和AKt蛋白表达的变化

图3血小板聚集率与血小板中PI3K表达和AKt磷酸化水平的相关性

3、讨论

研究[7,8]表明，血小板患者血小板中PI3K/AKt通路的表达增强，PI3K/AKt通路参与细胞活化、增殖、凋亡和其他过程，与血小板粘附、聚合和释放密切相关[9]。因此，可以认为PI3K/AKt信号传导途径的激活是血小板激活的机制之一，但产后深静脉血栓形成患者血小板活性和PI3K/AKt信号通路的变化仍有待证实[10]。因此，本研究分析血小板聚集率、PAF、CD62p、CD63以及PI3K/AKt通路的血小板活性指标和表达水平，以研究产后深静脉血栓形成患者的血小板活性变化及其机制。

本研究结果发现，研究组的5min最大血小板聚集率明显高于对照组。此外，PAF、CD62p、CD63三种血小板活性指标显著升高，表达水平与血小板聚集率呈正相关，提示产后深静脉血栓形成患者血小板聚集活性增加。这与Edwards等人[11,12]的研究结果一致，血小板粘附聚集是血栓形成的关键环节，血浆中的粘附分子与血小板表面糖蛋白受体结合，介导血小板聚集，血小板聚集物质在血栓患者中的表达增强，血小板在多种凝血因子的作用下活化，血小板膜糖蛋白和血浆粘附分子的表达显著升高，且大量促凝血血小板因子被释放到血液中[13]。因此，血栓形成促进PAF的表达[14]，并显著增加CD62p、CD63和其他血小板活性标记物的释放[15]。此外，通过5min最大血小板聚集预测产后深静脉血栓形成的ROC曲线下面积为0.797，表明产后下肢深静脉血栓形成的血小板聚集活性明显增强，对该病的发生具有一定的预测价值。

本研究结果发现，产后深静脉血栓形成患者的PI3Kp110β表达和AKt磷酸化水平显著高于对照组，表明PI3K/AKt通路在产后深静脉血栓形成患者中的表达增强。进行PI3Kp110β表达和AKt磷酸化水平与受试者血小板聚集率的相关性分析时发现，血小板聚集率与PI3Kp110β表达和AKt磷酸化水平呈正相关，表明产后深静脉血栓形成患者PI3K/AKt信号通路的增强可能是血小板聚集的机制之一。

综上所述，产后深静脉血栓形成患者血小板聚集活性增加，对产后深静脉血栓形成的发生具有一定的预测价值。此外，血小板PI3K表达和AKt磷酸化水平增加，提示PI3K/AKt信号通路可能是血小板聚集的机制之一。

参考文献:

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黑国真,蔡蕊,李昱,聂伟.血小板聚集率对产后下肢深静脉血栓形成的预测价值及其可能机制[J].中国妇幼保健,2020,35(17):3147-3150.

基金:山东省医药卫生科技发展计划(2018WS232);山东省医学科学院医药卫生科技创新工程(2016-01).