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3-MA及OPTN对稳转SOD1-G93A突变蛋白NCS-34细胞系中自噬通路蛋白作用

2025-03-20 95 上传者：管理员

摘要：目的探索以自噬通路抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)及慢病毒(LV)为载体介导的视神经病变诱导反应蛋白(LV-OPTN)对稳转超氧化物歧化酶1 (SOD1-G93A)突变蛋白的NCS-34细胞系自噬通路蛋白OPTN､p62､微管相关蛋白ⅠA/ⅠB轻链3 (LC3)､TANK结合激酶1 (TBK1)的变化｡方法采用稳转SOD1-G93A突变蛋白的NCS-34细胞系,并分为3组:无干预对照组､3-MA处理组(自噬通路抑制剂)､3-MA处理后给予LV-OPTN组,同时对3组细胞分别进行免疫荧光染色,特异性标记自噬通路蛋白p62､LC3､TBK1及OPTN,统计分析各蛋白的荧光含量｡结果与对照组相比,3-MA组细胞中自噬相关蛋白的荧光强度p62增多,而LC3､TBK1及OPTN均减少,与对照组相比差异有统计学意义(~均P<0.05);对于3-MA预处理后再给予LV-OPTN组,我们观察到自噬通路相关蛋白的荧光表达有一定程度的恢复,即p62减少,而LC3､TBK1及OPTN均增加,与3-MA组相比差异均有统计学意义(~均P<0.05)｡结论 3-MA抑制稳转SOD1-G93A突变蛋白的NCS-34细胞系中自噬蛋白的活性,而LV-OPTN重新激活自噬,逆转了3-MA诱导的自噬通路的抑制作用｡

关键词：
3-甲基腺嘌呤
神经元细胞系
肌萎缩侧索硬化
自噬通路
视神经病变诱导反应蛋白
超氧化物歧化酶1
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超氧化物歧化酶1 ( s upero xi de di s mut as e 1 ,S OD l )基因突变,如S OD 1- G9 3 A突变,是家族性肌萎缩侧索硬化症( amyo t rophi c l at e ral s cl eros i s , ALS )的常见原因之一｡携带S OD 1- G9 3 A突变的小鼠产生和ALS患者相同的肌肉萎缩无力等临床症状及神经兀坏死等病理改变[1]｡自趣( autophagy )在神经元的存活和稳态维持中起着关键作用,而自噬通路的异常与ALS的发生发展密切相关｡3-甲基腺嘌呤( 3-met hyl amphet ami ne , 3- MA )为自趣通路抑制剂,可有效抑制自噬体形成｡慢病毒( l ent i vi ru s , LV )是一种常用的基因转导技术,能够高效的将外源基因整合到宿主细胞的基因组中,维持长期稳定的表达,包括过表达､基因敲除､基因敲降等｡LV转导可高效地将转基因递送至哺乳动物细胞,尤其是难以转染的原代细胞｡LV是一种便捷的工具用于研究基因对细胞的功能影响｡本研究旨在深入了解3-MA及LV为载体介导的视神经病变诱导反应蛋白( l ent i vi rus opt i neuri n, LV-OPTN )对稳转S OD 1- G9 3 A突变蛋白的NC S -3 4细胞系自噬通路蛋白的影响｡

1、材料与方法

1 .实验

细胞､试剂与器材将S O D 1- G9 3 A突变蛋白稳定转染到N S C -3 4鼠神经元细胞系中,具体步骤是通过流式细胞仪分选成功转染S OD 1-G9 3 A突变蛋白的带有绿色荧光的细胞,并传代培养,条件为含有5 %0) 2的3 7 1培养箱中｡培养基是含有抗生素G4 1 8和1 0 %胎牛血清的Dul b e c c o改良E agl e培养基( dul b e c c o＇s mo d i fi e d eagl eme d i um , DM E M ) (美国I nvi t ro gen公司)｡在后续实验中,将2 X 1 07v g?ml/的LV-0PTN作用于稳转S OD 1- G9 3 A的NS C 3 4细胞系｡抗0PTN抗体(美国Ab e am公司) ,抗p 62抗体(美国S i gma- Al dric h公司) ,抗LC 3抗体(美国S i gma-Al dric h公司) ,抗TB K 1抗体(美国S i gmaAl drich公司) , Ho ech s t (美国I nv i t roge n公司) , 3- MA(美国S i gma Al dric h公司) , GV70 5载体, B amHI/ B amHI酶切,购自上海吉凯基因化学技术有限公司｡激光共聚焦显微镜(日本OLY MPUS公司, Zei s sLS M9 00) ,流式细胞仪(美国Be c t on Di c ki ns on公司,B D FAC S AriaTM)｡

2 .细胞系与分组

稳转S OD 1- G9 3 A突变蛋白的NC S 3 4细胞系在适宜的培养条件下培养｡将细胞分为以下3组:X寸照组:无任何干预; 3-MA组:给予自噬通路抑制剂3-MA处理; 3-MA + LV- 0PTN组:先给予3-MA处理,随后给予LV - 0PTN处理｡

3 _ LV- 0PTN载体病毒的包装

根据M N_1 8 1 84 8基因序列设计0PTN转染质粒,并进行测序验证｡0PTN质粒插入含有C MV增强子-MC S -3 FLAG-s v40 -嘌呤霉素的载体中｡病毒包被到LV衣壳中,在HE K 29 3 T细胞中转染LV载体｡然后将载体纯化并透析,利用定量PC R仪器检测载体病毒的滴度｡LV载体的浓度为8 E + 8 TU ?mL-1,将病毒溶液储存在-8 0冰箱备用｡

4 .免疫荧光染色

将细胞接种在含有玻璃小片的24孔板中,给予相应处理及培养后,弃去培养液,用4 %多聚甲醛将细胞固定｡染色前在〇. 3 %Trit on X-1 00 PB S中洗涤,并用1 0%马血清封闭｡样品与相应比例的兔抗0PTN､兔抗LC 3､抗TB K 1､抗P6 2抗体在4 1下孵育1 2h｡细胞核用Ho e c hs t染料染色,并在室温下加人适当的荧光二抗避光孵育l h｡将玻璃小片捞出放置于载玻片上,加人抗荧光衰减剂,所有照片均使用共聚焦扫描显微镜拍摄｡

5.统计学方法

利用SPS S26 . 0统计软件,各组之间数据的差异性采用方差分析统计方法,计量资料用均数±标准差U ± s )来表示,以0 . 0 5为差异有统计学意义｡

2、结果

1 . LV载体质粒结构图(图1 )

图1 LV病毒载体的图谱

通过对GV7 0 5慢病毒载体的改造和病毒包装,获得带有OPTN基因序列的LV颗粒,进行后续实验操作｡

2 .给予3- MA处理及3- MA处理后再给予LV-OPTN干预,各组细胞中OPTN荧光含量变化图(图2 )

图2免疫荧光染色显示0PTN的荧光强度变化

从图2可以清晰地看出,对照组中0PTN蛋白表达处于一定基础水平｡与对照组相比, 3-MA组的0PTN表达显著降低,在3-MA预处理后再给予LV-0PTN的3-MA + LV-0PTN组, 0PTN表达较3-MA组显著升高,且高于对照组｡这表明3-MA能够抑制0PTN的表达,当在3-MA抑制的基础上给予LV-0PTN时,能够缓解3-MA的抑制作用,并且恢复到正常水平,提示3-MA可能对自噬通路造成了抑制作用,补充0PTN可以缓解这一作用｡

3 .给予3- MA处理及3- MA处理后再给予LV-0PTN干预,各组细胞中P 6 2荧光含量变化图(图3 )

图3免疫荧光染色显示P62的荧光强度变化

如图3所示,对照组中P62蛋白表达处于一定基础水平｡与对照组相比, 3-MA组的P 62表达显著升高,表明自噬受到抑制｡在3-MA预处理后再给予LV- 0PTN的3-MA + LV- 0PTN组, P 62表达较3-MA组有所下降,这表明LV- 0PTN能够促进P6 2的降解,从而增强自噬流,而3-MA则显著抑制了这一过程｡结果表明3-MA可能对自噬通路造成了一定的抑制作用,但补充LV- 0PTN后,能缓解3-MA的抑制作用｡

4 .给予3- MA处理及3- MA处理后再给予LV-0PTN干预,各组细胞中LC 3荧光含量变化图(图4 )

图4免疫荧光染色显示LC3的荧光强度变化

如图4所示,对照组的LC 3与S 0D 1含量及共定位情况,对照组中LC 3呈现典型的点状分布模式｡3-MA组的LC 3表达显著降低,反映出自噬受到强烈抑制,自噬体形成减少｡3-MA + LV- 0PTN组的比例相较于3-MA组的LC 3表达有所上升,提示LV-0PTN对3- MA诱导的自噬抑制有缓解作用,进一步说明3-MA对自噬早期阶段的抑制作用较为显著｡

5 .给予3-MA处理及3-MA处理后再给予LV-OPTN干预,各组细胞中TB K 1荧光含量变化图(图5 )

图5免疫荧光染色显示TBK1的荧光强度变化

图5表明,对照组中TB K 1蛋白表达维持在特定范围｡3-MA组的TB K 1表达显著降低,表明3-MA不仅抑制了自噬体的形成,还可能影响了TBK 1介导的自噬相关信号传导｡3-MA+ LV-OPTN组的TB K 1表达较3-MA组有所回升,显示LV- OPTN在一定程度上能够改善3-MA对TB K 1表达的抑制｡

3、讨论

自噬是一种进化上保守的真核降解途径,参与细胞蛋白和细胞器的更新和消除＇自噬过程的特征是通过双膜结构自噬体吞噬细胞质底物,形成自噬体(双膜胞质囊泡) ,随后将其与溶酶体融合在一起,形成自噬溶酶体从而将底物降解E \病理学显示自噬在ALS中占据核心作用,包括患者运动神经元中蛋白质聚集体和线粒体肿胀或营养不良线粒体的积聚[ 4]｡多个ALS相关基因的蛋白质产物与自噬的动力学或调节有关｡其中P 6 2/ S QSTM 1[5 ],一种泛素结合蛋白,与蛋白质聚集体12 1和受损的线粒体[ 6 ]相关｡而OPTN是另一种泛素结合蛋白,也与聚集蛋白[ 7 ]和去极化或受损线粒体[ 6]的自噬清除有关｡P6 2和OPTN都被募集到泛素化底物中,并通过微管相关蛋白1 A/ 1 B轻链3 ( l i ght c h ai n 3 , LC 3 )结合基序被自噬体诱导其隔离[8 ]｡通过外显子组测序鉴定TANK结合激酶1 ( TANK-b i n di ngk i nas e 1 , TB K 1 )为ALS的连接基因,是一种可磷酸化P 62和OPTN的激酶[ 9 1 ( )]｡相关细胞实验确定了p 62､OPTN和TBK 1在蛋白质聚集体的自曬清除以及线粒体自噬中的重要作用M｡自噬功能障碍可产生异常蛋白及RNA聚集体,导致神经元变性死亡〇OPTN是作为一种重要的线粒体自噬接头蛋白,由长卷曲螺旋区､亮氨酸拉链和LI R以及UBAN和锌指结构域组成[ 1 2]｡最近的实验证据表明, OPTN在Parki n介导的线粒体自噬过程中与多个自噬成分相互作用[1 3]｡在A LS模型小鼠中鞘内注射腺相关病毒携带的OPTN可延长小鼠的生存期,从而表明OPTN对于疾病的重要作用[ 8 ]｡3-MA是一种通过抑制HI类PI 3 K来抑制自噬/溶酶体途径的药物[2〇],已被广泛用于研究自噬在许多研究领域的作用,文献报道3-MA可抑制LC 3_I向LC 3-I的转化[1 4 ]｡本研究结果显示,自噬通路抑制剂3-MA X才稳转S 0 D 1- G9 3 A突变蛋白的NC S -3 4细胞系自噬通路产生显著影响｡3-MA处理后,自噬相关蛋白P 62增多, LC 3､TB K 1及OPTN减少,这表明3-MA抑制了该细胞系中的自噬过程｡自噬在细胞内稳态维持和应对异常蛋白积累等过程中发挥关键作用, 3- MA的这种抑制效果可能会干扰细胞正常的自噬清除功能,进而影响细胞的生理状态U5 ]｡正常自噬过程中, P6 2会携带被标记的待降解物质进入自噬体｡当自噬受抑制时P 6 2积累,而OPTN恢复自噬后可以让P 62被正常运输到自噬体中并随后被溶酶体降解,从而减少P6 2在细胞内的含量[i q｡对于TB K 1蛋白, OPTN可能参与其激活过程｡TB K 1在自噬小体与溶酶体融合等环节发挥重要作用[1 7 ]｡OPTN可能通过调节TB K 1的磷酸化状态等方式来激活TB K 1 ,进而修复3-MA干扰后的自噬通路下游事件[1 8 ]｡例如,激活后的TB K 1能够帮助自噬小体更好地识别并融合溶酶体,增强自噬的降解功能間｡而在3- MA预处理后给予LV - OPTN的处理组中,自噬通路相关蛋白的荧光表达有恢复趋势, P6 2减少, LC 3､TB K 1及OPTN增加｡这一现象提示LV -OPTN能够重新激活自噬,逆转3-MA诱导的抑制作用｡这可能是由于LV - OPTN通过其特定的作用机制,恢复了自噬通路相关蛋白的功能和表达水平,从而使自噬过程重新启动｡本研究结果对于理解S 0D 1- G9 3 A突变相关的细胞病变机制具有重要意义｡自嗷通路的异常可能在神经退行性疾病的发展中扮演重要角色,而通过调控自噬相关蛋白的活性或许能为这类疾病的治疗提供新的思路[ 2〇]｡后续研究可进一步在动物模型中验证,更深人地探索自噬在神经退行性病变中的作用及潜在治疗价值｡

基金资助:河北省自然科学基金青年科学基金项目(H2021206048);河北省医学科学研究课题计划(20240793);

文章来源:温迪,王娟,李媛媛,等.3-MA及OPTN对稳转SOD1-G93A突变蛋白NCS-34细胞系中自噬通路蛋白的作用[J].脑与神经疾病杂志,2025,33(04):235-239.