糖尿病肾病(DKD)是糖尿病中最常见的微血管并发症，多发展为终末期肾病[1]。遗传因素、氧化应激、炎性反应等多种因素均能诱导发病[2],高血糖、吸烟、肥胖、长期摄入高蛋白和作息紊乱等的都是诱发糖尿病高发性因素[2-3]。DKD发展早期与肾小管损伤、肾小球硬化，间质细胞纤维化以及炎性细胞浸润有密切的关系[4-5]。作为四大南药之一的益智仁，对DKD具有较好的保护作用[6]。益智仁，为姜科植物益智的果实，具有温脾止泻摄涎，暖肾缩尿固精之功效。常用于肾虚遗尿，尿频等。有研究发现，益智仁水煎液可以通过降低血糖、调节血脂、减少尿微量白蛋白的排泄，降低氧化应激反应[7-11],起到对早期DKD肾脏的保护作用。RhoA/ROCK信号通路在人体内稳态有着重要的作用和功能，其重要的功能包括调节细胞外基质的凋亡、生存、重塑、基因表达以及细胞骨架的重组和黏附、分化、迁移、成熟等[12-13]。肾小管上皮-间质转分化(epithelial-to-mesen chymaltransition, EMT)是肾间质纤维化，最终导致终末期肾病的主要原因之一，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)具有较强致纤维化作用，可激活RhoA,RhoA激活后可激活下游ROCK,激活后的RhoA/ROCK信号通路参与EMT过程，导致肾间质纤维化[14]。基于此笔者提出假设通过益智仁抑制RhoA/ROCK探讨对DKD的防治和机制研究。

1、材料与方法

1.1细胞株来源

人肾小管上皮细胞株HK-2:武汉普诺赛生命科技有限公司

1.2试剂

益智仁(C026181218),卡格列净(S14202853448),PBS缓冲液(Hyclone),qPCRGreen Master Mix(YEASEN),FBS胎牛血清(YEASEN),CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁),HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis(YEASEN),SuperMix for qPCR(gDNA digester plus),逆转录试剂盒(YEASEN),EastepSuper总RNA提取试剂盒(Promega)

1.3仪器

高速低温离心(麦克奥迪),凝胶成像系统(艾科仪器),倒置显微镜(上海力辰邦西仪),q225荧光定量PCR(Monad),水浴锅(邦西仪器科技有限公司),千分之一天平(PULISITE),恒温金属浴(BIOERPCR),扩增仪(北京创誉科技有限公司),CO2培养箱(上海博迅),多功能酶标仪(BIOTEK),生物安全柜(苏州净化设备有限公司),BD ACCURI C6PLUS流式细胞仪(BD),全自动立式高压灭菌锅，(SHENAN),NanoDrop超微量分光光度计(Thermo),垂直电泳槽(Bio-Rad),电泳仪(Bio-Rad)。

1.4方法

1.4.1细胞复苏：

将冻存于液氮的HK-2细胞取出，37℃的恒温水浴3～5 min,将其转移至离心管中，加入3～5 mL 10%DMEM培养基重悬，1 000～1 200 r/min离心3～5 min,去上清加入3～5 mL培养基重悬转移至25 cm2培养瓶培养24 h观察。

1.4.2细胞培养：

观察细胞生长情况以及培养基消耗情况，细胞培养≤72 h。期间进行细胞换液，长至80%以上的细胞传代，将培养瓶中废液吸出，加入2 mL左右PBS清洗，加入1～1.5 mL的胰酶消化1 min后加入1～1.5 mL培养基终止消化，转入离心管，1 000～1 200 r/min离心3～5 min,去上清，加入培养基重悬分装，如一传二则各补加培养基于培养瓶中。

1.4.3 CCK8检测细胞活力：

将细胞消化离心重悬后，计算浓度细胞后，按照96孔板每孔1 500个细胞进行铺板，培养24 h,加入30 mmol/L的高糖造模48 h,造模后加入相应药液干预24 h,每孔加入10μL CCK8试剂，检测细胞活力。

1.4.4总RNA提取：

RNA提取选用Eastep®Super总RNA提取试剂盒进行细胞RNA的提取，NanoDrop超微量分光光度计检测RNA浓度>100 ng/μL且取A260/230 2.0～2.3,A260/A280 1.9～2.1范围内的RNA样品。用2%的琼脂糖凝胶跑胶观察RNA条带。

1.4.5 RNA逆转录：

使用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)逆转录试剂进行逆转录，逆转录反应条件为：25℃5 min, 42℃30 min, 85℃5 min。使用Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix试剂进行cDNA扩增，扩增条件：预变性95℃5 min。变性和退火/延伸分别是95℃10 s和60℃30 s 40个循环。

1.4.6流式细胞术

1.4.6.1 HK-2细胞凋亡率检测：

凋亡采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。用6孔板铺细胞数量为3～5万每孔1 d后，浓度为30 mmol/L葡萄糖培养基诱导48 h,药物处理24 h后消化细胞，细胞数量控制在1×105～1×106/孔。取细胞上清于1.5 mL EP管。用PBS清洗，用无EDTA的胰酶消化，开始松动脱落下来时，吸出胰酶，加入细胞上清终止消化，将细胞吹打下来，尽量把细胞吹散为单个细胞，转入EP管中。1 000 g/min离心5 min,取上清。加入2～3 mL PBS清洗，1 000 g/min离心5 min。分组：正常组、模型组、阳性对照组(卡格列净组)、益智仁组。并按照说明书进行操作完成。使用铝箔进行室温避光孵育30 min,随即放在冰盒中，上机检测。上机前用筛网过滤得到单细胞悬液，避免损坏仪器。存活率公式：(测定组-空白组)/(正常组-空白组)×100%

1.4.6.2 HK-2细胞ROS活性氧检测：

采用Reactive Oxygen Species Assay Kit活性氧检测试剂盒其细胞培养方式和上述相同，用0.5～1 mL胰酶消化细胞2～3 min,用等体积培养基终止消化，以1 000 g/min离心5 min。去上清，加入1 mL PBS重悬。离心沉淀细胞。阳性对照：用无血清培养基将阳性对照从100 mmol/L稀释至100μmol/L,加入500μL体积，37℃避光孵育0.5～4 h。ROS探针：探针按照1∶1 000的稀释比例用无血清培养基稀释，终浓度为10μmol/L,每管加入500μL,37℃避光孵育0.5～4 h。过滤：用过滤网过滤，形成单个细胞液，避免对仪器的损伤。

1.4.7含药血清的制备：

将益智仁用温水泡20 min,武火煮开后文火煎20 min,倒出药液。15只4周龄SD大鼠(平均体重300 g/只)随机分为3组，正常组5只，益智仁组5只、卡格列净组5只。(大鼠与成人的给药剂量折算系数为：6.3。具体于灌胃前再测算，且在灌药期间每周测算体重，更新灌药量)正常组灌等量0.9%氯化钠溶液、益智仁组和卡格列净组分别每天给予相应药物2次，第7天后，给药后2 h大鼠腹主动脉无菌采血。静置2 h, 5 000 r/min冷冻离心30 min,取上清，用EP管分装。经56℃金属浴30 min灭活处理，-80℃低温保存。

1.4.8 Western blot:

①蛋白质提取细胞长至100%时进行处理。吸出废液，加入2～3 mL PBS清洗后，加入1～1.5 mL的胰酶消化，再用1～1.5 mL培养基终止消化，1 000～1 200 r/min离心5 min,弃上清，用1 mL PBS重悬后，加入裂解液(含蛋白酶抑制剂),冰浴裂解20 min, 4℃10 000～12 000 r/min离心5 min,取上清，用BCA法测定蛋白的浓度。加入上样缓冲液水浴使蛋白变性。制胶，电泳，转膜，脱脂牛奶封闭1.5 h,一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1.5～2 h,显影并用image采集图像并分析条带灰度值。

1.5统计学分析

应用GraphPad Prism统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1益智仁含药血清对HK-2细胞增殖活力的检测

CCK-8检测细胞活力，益智仁组和卡格列净组较模型组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2益智仁含药血清对RhoA/ROCK信号通路相关蛋白的检测

4组分别比较，模型组中α-SMA与E-cadherin蛋白的表达明显升高，益智仁组和卡格列净组较模型组表达明显降低，与正常组相比蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2,图1。

表1 4组HK-2细胞存活率

表2 4组HK-2细胞RhoA/ROCK信号通路相关蛋白的相对表达量

图1 4组HK2细胞RhoA/ROCK信号通路相关蛋白Western blot图

2.3 RhoA/ROCK信号通路相关基因表达差异

卡格列净和益智仁组中α-SMA、E-Cadherin、RhoA、ROCK、TGF-β、RAC1的mRNA表达较模型组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组HK2细胞RhoA/ROCK信号通路相关基因的相对表达量

2.4 HK-2细胞凋亡率检测

HK-2细胞高糖诱导后用药物处理，卡格列净组和益智仁组较模型组比较细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2,表4。

图2 4组HK-2细胞凋亡率；

表4 4组HK-2细胞凋亡率

2.5流式细胞术检测氧化应激状态

卡格列净和益智仁组活性氧化物ROS较模型组明显降低，药物处理后的HK-2细胞的氧化应激反应得到有效抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5,图3。

表5 4组HK-2细胞ROS含量

图3 4组HK-2细胞中ROS含量；

3、讨论

随着经济的发展，人们的生活水平的提升，糖尿病患者的人数逐年增加，且目前没有特效疗法，只能靠预防和控制病情为主。由于其发病机制复杂，糖尿病已对我国人民健康造成严重的威胁。

DKD是糖尿病较为严重的并发症之一，常发展为终末期肾脏疾病，具有高致死率。DKD早期发生发展常伴随有肾小管间质纤维化、肾小球硬化、氧化应激、炎性反应病理改变等，而EMT是导致DKD肾间质纤维化，发展为终末期肾脏疾病的重要因素之一[15],RhoA/ROCK信号通路是参与肾小管上皮细胞EMT的过程的主要信号转导通路之一，其跟DKD的发生发展有密切的联系[16]。有研究显示，当RhoA/ROCK通路受到抑制时，肾小管间质纤维化得到了有效的改善[17]。肌纤维母细胞的标志物为α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),DKD发展为终末期肾病的一个重要病理改变就是肾小管间质纤维化[18],肾小管纤维化的重要检测指标α-SAM,其变化与肾小管间质损伤有着密切关系。在高糖环境刺激下，α-SMA出现异常升高，使大鼠肾上皮细胞出现肿胀坏死，通过抑制α-SMA的表达能够减轻糖尿病大鼠肾小管间质的损伤，对肾脏具有一定的保护作用[19]。TGF-β1有着较强致纤维化的能力，能激活RhoA/ROCK信号通路， 诱导EMT过程及α-SMA表达[7, 20],同时TGF-β1也是参与炎症、器官纤维化、创伤等生理过程的重要细胞因子。高糖刺激下会使TGF-β1的表达上调，导致肾细胞外基质沉积增多及体内炎症小体激活，引发肾脏炎症，从而导致肾脏的纤维化[21]。E-钙黏蛋白(E-cadherin)属于钙离子依赖黏附素家族，对细胞与基质间的黏附和维持上皮细胞形态完整和极性起着调节作用，以及修复机体损伤等作用[22]。在DKD患者中由于肾小管上皮细胞缺血、凋亡使蛋白水解酶活性增加，加速了E-cadherin降解和分裂，使从损伤的肾小管排泄到尿液中的E-cadherin呈高表达[23]。有研究表明，DKD中肾间质纤维化与E-cadherin密切相关[24]。Rac1属于Rho家族小G蛋白，在调节增殖、凋亡、分化中起着重要作用[25],也有研究表明，肾小管纤维化的另一主要原因是高糖诱导下的肾小球间充质细胞的增殖、肥大和凋亡[26]。当RAC1基因被敲除或抑制时，肾小球间充质细胞活性增加，凋亡降低，对肾小球起到一定的保护作用[27]。此外，氧化应激可导致实质细胞的凋亡、坏死和局部炎症，进而导致肾小球硬化和间质细胞纤维化[28]。中药对DKD的治疗作用具有多途径多靶点的特点。而RhoA/ROCK信号通路是其中主要的信号通路之一。中药能通过抑制RhoA/ROCK信号通路，下调炎性因子的表达[29-31],减少氧化应激[32],降低高糖对肾细胞功能的破坏，发挥保护肾脏的作用。

本实验在基于RhoA/ROCK信号通路探讨益智仁对DKD的防治疗作用及其机制研究，采用CCK-8法检测HK-2细胞的细胞存活率、流式细胞术检测HK-2细胞在高糖和药物干预下的凋亡率和氧化应激状态。通过实验结果可知，对于高糖诱导后的肾小管上皮滑膜细胞，益智仁能够有效地抑制细胞凋亡、改善细胞活性和降低细胞中氧化产物ROS的含量，减少高糖对细胞的损伤。通过检测RhoA/ROCK信号通路相关蛋白和基因的表达水平时，本研究发现糖损伤的HK-2细胞在给予益智仁含药血清干预后，其α-SMA和E-cadherin较模型组HK-2细胞的基因和蛋白表达明显降低，表明益智仁能通过调节蛋白和基因的表达有效改善肾小管上皮细胞纤维化和调节细胞黏附，修复细胞的损伤。TGF-β1能激活RhoA/ROCK诱导EMT和引起炎性反应，促进细胞进行纤维化的发生发展，用药后TGF-β1、RhoA、ROCK表达均明显降低，能够明显地改善肾小管上皮细胞损伤和纤维化。

综上所述，益智仁能够有效地抑制RhoA/ROCK信号通路，抑制细胞凋亡，调节细胞增殖及抑制细胞氧化应激状态和炎性反应等，进而改善肾小管上皮滑膜细胞纤维化的发展，对DKD起到一定的防治作用。

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基金资助:国家自然科学基金(编号:82060851);成都中医药大学附属医院代谢性疾病中医药调控四川省重点实验室开放基金资助(编号:SZKF202203);

文章来源:王芳玉,韩汶龙,马天鹏,等.基于RhoA/ROCK通路探讨益智仁对糖尿病肾病防治作用及机制研究[J].河北医药,2024,46(18):2732-2736.