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糖尿病认知障碍大鼠脑组织形态学及GAP-43蛋白表达

2025-02-08 59 上传者：管理员

摘要：目的探讨糖尿病认知障碍大鼠脑组织形态学变化及生长相关蛋白(GAP)-43蛋白表达变化。方法雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组，实验组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建1型糖尿病模型，Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力，苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织形态学变化，Western印迹和免疫组织化学(IHC)法检测GAP-43蛋白表达变化。结果实验组较对照组空腹体质量增长明显缓慢，空腹血糖明显升高(P<0.01);Morris水迷宫实验中，相较于对照组，实验组平均逃避潜伏期存在显著差异，穿越平台次数明显减少(P<0.05,P<0.01);HE染色显示，对照组脑组织神经元结构完整、形态正常，实验组脑组织锥体细胞数量减少、形态发生变化；Western印迹和IHC结果显示，实验组较对照组脑组织中GAP-43蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论糖尿病大鼠出现认知功能障碍可能与GAP-43蛋白表达降低有关。

关键词：
前额叶皮质
海马
生长相关蛋白(GAP)-43
糖尿病认知障碍
脑病
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糖尿病作为最常见的慢性进展性疾病之一，严重影响人类健康。糖尿病一旦发生，除了疾病本身之外，引发的并发症不断折磨患者的身体和心理，如眼病、足病、肾病和脑病，其中中枢神经系统并发症以糖尿病脑病最为常见〔1〕。慢性高血糖可缓慢引起认知功能障碍和神经生理结构异常称为糖尿病认知障碍。海马体和前额叶皮质是与学习记忆相关的解剖学和功能基础〔2〕，其生理结构和功能异常会严重影响大脑的学习和记忆能力。生长相关蛋白( GAP) -43是一种神经突触膜蛋白，对神经生长、损伤修复、突触可塑性等方面有重要作用〔3〕，然而这种蛋白质水平与学习记忆之间的关系仍未知。本研究探讨糖尿病认知障碍大鼠脑组织形态学及GAP43蛋白表达。

1、材料与方法

1. 1动物与分组

选取20只10周龄、体质量( 250±10) g的雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组各10只。动物被饲养在桂林医学院动物中心，60%～70%相对湿度、( 22±2)℃温度和12 h光-暗循环的生存环境，实验期间动物可自由获得生存所必需的食物和水。

1. 2主要试剂和仪器

血糖仪(强生医疗器械有限公司)、Morris水迷宫(欣软信息科技有限公司)，GAP-43抗体( Bioss公司)。

1. 3糖尿病模型建立

大鼠提前禁食6～8 h，记录大鼠体质量，尾静脉法测量血糖水平。根据体质量计算大鼠注射量，以腹腔注射链脲佐菌素( STZ)50 ml /kg的浓度( STZ溶解在0. 1%、pH = 4. 2的柠檬酸钠缓冲液中)对实验组大鼠进行糖尿病模型诱导。注射STZ 72 h后，血糖仪、体质量秤记录两组大鼠空腹血糖( FPG)和体质量，其中造模成功定义为FPG≥11. 1 mmol /L〔4〕。随后大鼠继续常规饲养16 w，每4 w监测体质量、血糖变化。

1. 4大鼠学习记忆能力评价

Morris水迷宫实验是检测啮齿类动物学习记忆能力的有效方法之一〔5〕。实验使用水迷宫装置系统记录和分析大鼠的行动踪迹。整个实验共进行6 d，第1天使大鼠对实验环境进行适应性训练，每只大鼠被依次放入水迷宫中自由探索120 s。第2～5天，每只大鼠被允许搜索平台120 s，在此期间搜索到平台时间记录为逃避潜伏期，若未搜索到平台，逃避潜伏期被自动记录为120 s并手动引导大鼠至平台15 s，每只大鼠学习试验4次/d。第6天进行空间探索试验，平台被移除，大鼠被放入平台相对象限，记录120 s内大鼠完整穿越平台的路径次数。平均逃避潜伏期和穿越平台次数均有统计学意义定义为存在认知功能障碍。

1. 5大鼠脑组织取材

水迷宫结束后，大鼠被麻醉，然后经心灌注冷磷酸盐缓冲液( PBS)，仔细解剖大脑并迅速分为两半〔6，7〕，一半迅速转移至冰上取其海马和前额叶皮质组织，后续用于Western印迹检测，另一半浸泡于4%多聚甲醛用于染色。

1. 6苏木素-伊红( HE)染色检测脑组织神经元形态变化

组织固定完成后，经脱水透明后进行常规石蜡包埋操作，被放置于石蜡切片机中的蜡块进行连续切片，获得4μm的组织薄片进而固定于载玻片上。切片置于二甲苯溶液中常规脱蜡，一系列醇溶液中梯度脱水，使用苏木素和伊红染液常规染色，随后逐级酒精脱水、透明后进行封片观察。

1. 7 Western印迹

检测脑组织中GAP-43蛋白表达获取的组织加入裂解缓冲液〔组织裂解液苯甲基磺酰氟( PMSF) = 100∶1〕后得到组织匀浆混合物，并在12 000 r/min离心20 min，操作结束后收集上清液，部分上清液二喹啉甲酸( BCA)测蛋白浓度，剩余样本经蛋白变性在水浴锅中煮沸10 min，向聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中加入蛋白上样样本并电泳。蛋白通过湿转法转移到聚偏氟乙烯( PVDF)膜上，据一抗( GAP-43，1∶1 000)制造商的说明书进行膜封闭和抗体染色。隔日洗膜孵育二抗(抗兔，1∶5 000)，洗膜发光，条带分析。

1. 8免疫组织化学( IHC)法检测

脑组织中GAP-43蛋白表达切片在二甲苯和等级递减的醇溶液中水化，经微波抗原修复、10% H2O2阻断剂、5%山羊血清溶液封闭后含Tween-20的磷酸盐缓冲液( PBST)洗涤，切片与一抗( GAP-43，1∶150)在4℃共同孵育过夜。次日，切片置于二抗溶液中37℃孵育箱30 min，PBST洗涤后根据染色情况决定二氨基联苯胺( DAB)显色液染色时间，随后复染，进而逐级脱水透明后封片，镜下观察。

1. 9统计学分析

采用SPSS25. 0软件进行独立样本t检验。

2、结果

2. 1各组FPG水平与体质量变化造模后实验组FPG水平较对照组显著升高( P＜0. 000 1)，且饲养期间实验组持续高血糖。实验组造模4 w后空腹体质量水平显著低于对照组( P＜0. 01)。见表1。

表1各组不同时间点FPG水平及体质量比较

2. 2 Morris水迷宫实验中各组行为学变化

定位航行实验中，随着时间慢慢推移，两组逃避潜伏期逐渐趋于平稳，实验第3天与第4天与对照组相比，实验组表现更差，有统计学意义( P＜0. 05)。空间探索实验中，与对照组相比，实验组穿越平台次数显著减少( P＜0. 01)。见表2。

2. 3脑组织中GAP-43蛋白表达

Western印迹结果显示，实验组海马和前额叶皮质组织中GAP-43蛋白表达相较对照组显著降低( P＜0. 01)。IHC染色显示，GAP-43蛋白在脑组织中主要表达在胞膜，相较对照组，实验组海马和前额叶皮质组织中GAP-43蛋白阳性染色显著减少( P＜0. 01，P＜0. 001)。见表2、图1、图2。

表2各组行为学及GAP-43蛋白表达比较

图1两组海马及前额叶皮质组织中GAP-43蛋白表达

2. 4 HE染色检测脑组织神经元形态变化对照组脑组织神经元有序排列，细胞结构完整，形态正常。实验组脑组织神经元间隙增加，染色较浅，轮廓不清晰，细胞形态无规则，偶见少量细胞出现胞质深染、胞核固缩。见图3。

图2两组海马和前额叶皮质中GAP-43蛋白表达( IHC染色，×400)

图3两组脑组织神经元形态变化( HE染色，×400)

3、讨论

目前有证据表明糖尿病可能与认知障碍等神经退行性疾病有关〔8〕。本实验结果显示，1型糖尿病合并认知障碍大鼠模型成立。海马体和前额叶皮质在认知功能研究中发挥核心作用，其损害可能与记忆障碍有关〔2〕。海马体对记忆形成和检索至关重要，前额叶皮质可能在一定程度上负责积累相关记忆〔9，10〕。记忆经大脑皮层输入，并通过N-甲基-D-天冬氨酸( NMDA)受体介导的突触可塑性快速编码为记忆，暂时存储在海马体-新皮层网络中〔11，12〕。更重要的是，经过一段时间的系统巩固后，海马体的记忆便完全储存于新皮层即前额叶皮质区域〔13〕，因此两者结构和功能的异常会严重影响大脑认知功能。本研究结果显示，实验组脑组织形态学变化可能与行为学发生改变有关，在受影响的T1DM大鼠海马体中也获得了类似结果〔7〕。GAP-43蛋白作为一种仅存在于神经系统的蛋白，在生长初期大量存在供给神经生长，缺乏这种蛋白质的小鼠在生长早期存活率较低，待神经生长成熟后，蛋白含量逐渐下降并趋于平稳〔14〕，但相对于其他系统来说，神经系统内仍然高表达，因此蛋白过表达可以促进神经生长。神经营养因子信号在损伤后，神经生长因子可上调对谷氨酸的反应，促进神经生长和突触发生，如果没有GAP-43，脑源性神经营养因子的作用可能被阻断〔15〕，但在缺乏额外营养因子的情况下，GAP-43也能使神经元萌发新的终末细胞，因此该蛋白可以被认为是神经元生长过程中脑源性神经营养因子的重要决定因素〔16〕。GAP-43参与神经损伤的修复和再生，在神经系统损伤早期，GAP43在近端轴突残端的轴索生长锥中强烈上调，这是身体对损伤的保护性反应，以代偿轴突缺失〔14，17〕。随着持续性高血糖，神经受损程度逐渐加重，GAP-43蛋白表达受到限制，因此表达量逐渐减少。GAP-43是一种关键的突触前蛋白，本研究中，实验组脑组织中GAP-43免疫阳性神经元显著减少，因此脑组织中GAP-43表达降低可能是认知能力下降的原因之一。GAP-43染色的减少与海马、前额叶皮质神经元密度的减少及糖尿病诱导后行为学发生改变可能是一致的。研究证明，GAP-43表达或轴突递质转运缺陷可能导致糖尿病的周围神经再生受损〔18〕。研究发现，人类阿尔茨海默病( AD)脑组织中GAP-43蛋白表达降低可能是由于神经元密度降低、递质释放减弱或轴突外生长减弱〔19〕，提示突触可塑性是探究糖尿病认知功能障碍的重要发病机制〔20〕。综上，GAP-43蛋白在糖尿病认知障碍中可能发挥至关重要作用，T1DM大鼠行为学变化可能与GAP-43蛋白表达降低有关。

基金资助:国家自然科学基金项目(81960163);

文章来源:张雪,杨普程,李孟知,等.糖尿病认知障碍大鼠脑组织形态学及GAP-43蛋白表达[J].中国老年学杂志,2025,45(03):636-640.