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基于网络药理学探讨冬虫夏草治疗糖尿病肾病的作用机制

2022-04-15 667 上传者：管理员

摘要：目的通过网络药理学探讨冬虫夏草治疗糖尿病肾病方面的作用机制研究。方法首先利用TCMSP平台检索冬虫夏草的化学成分和作用靶点，并通过Gene Cards、OMIM、TTD和CTD等数据库筛选出治疗糖尿病肾病的靶标，借助Uniprot数据库对靶点进行基因注释，基于STRING 10.0构建PPI蛋白互作网络，通过R语言中的Bioconductor平台数据包中的org.Hs.eg.db对基因进行编码；再使用R语言插件中的stringi、colorspace以及Bioconductor平台中的cluster Profiler、DOSE、pathview三个数据包，进行基因本体(Gene ontology,GO)分析和基于京都基因与基因百科全书(KEGG)信号通路富集分析；取药物-疾病交集基因通过Cytoscape3.7.2构建药物-化合物-靶点网络，最后将网络中度值较高的成分与核心靶点进行分子对接。结果筛选出冬虫夏草7个活性成分，糖尿病肾病靶点共2 987个，其中糖尿病肾病-冬虫夏草共同作用靶点41个，GO条目863条，其中生物过程共775条，细胞组成共27条，分子功能共61条；KEGG信号通路共133条，涉及细胞凋亡、癌症、炎症等信号通路；分子对接结果显示主要活性成分与靶点均能自发结合。结论该研究初步揭示了冬虫夏草通过多成分-多靶点-多通路治疗糖尿病肾病的作用机制，为冬虫夏草的机制研究提供理论依据。

关键词：
中药材
作用机制
冬虫夏草
糖尿病肾病
网络药理学
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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)糖尿病患者最主要的合并症之一，由于其复杂的代谢机制紊乱导致患者一旦达到终末期肾脏病，则治疗极为棘手，故而在糖尿病肾病前期有效预防极为关键[1]。冬虫夏草(cordyceps sinensis,CS)归肺、肾二经，具有补肾益肺之功效，是我国最名贵的中药材之一，其药用价值在近年来广受追捧，有“百药之王”的美誉，是我们医学领域使用最广泛的一类中药材[2]。目前临床上广泛使用人工发酵的冬虫夏草菌株(金水宝、百令胶囊)联合血管紧张素受体阻断剂(ARB)或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)治疗早期糖尿病肾病，延缓其进展，临床疗效显著[3,4]。但是关于冬虫夏草治疗糖尿病肾病主要是从临床观察指标出发，并未从药理学机制出发探讨冬虫夏草治疗糖尿病肾病的机制。本文从网络药理学的机制出发探讨冬虫夏草对糖尿病肾病的作用机制。

1、资料与方法

1.1冬虫夏草的活性成分筛选

本研究通过TCMSP[5](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)平台，以“冬虫夏草(Cordyceps sinensis)”为关键词搜索其全部活性成分。利用口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，药物类似性(drug likeness,DL)≥0.18为筛选条件，筛选出冬虫夏草的活性成分。

1.2收集冬虫夏草的相关靶点信息

在TCMSP数据库中输入“冬虫夏草(Cordyceps sinensis)”，作为关键词搜索，选择“Related Targets”栏，将“冬虫夏草(Cordyceps sinensis)”相关靶点共62个，复制并导出为excle格式，并通过Uni Prot数据库(https：//www.uiprot.org/)中的Uni Prot Knowledgebase查询其symbol。

1.3获取糖尿病肾病的相关基因

分别在Gene Cards数据库(http：//www.genecards.org/)、CTD数据库(http：//ctdbase.org/)，OMIM数据库(https：//omim.org/)，TTD数据库(http：//db.idrblab.net/ttd/)中输入“diabetic nephropathy”关键词作为检索条件，对糖尿病肾病相关的人类基因进行搜索，并将所有疾病基因全部下载取并集共2 987靶点基因，汇总为excle格式。

1.4冬虫夏草与糖尿病肾病疾病的靶点基因交集

将所得到的冬虫夏草靶点基因62个与糖尿病肾病的相关基因2 987个通过VENN网站(https：//bioinfogp.cnb.ic.es/tools/venny/)查询冬虫夏草与糖尿病肾病的交集靶点。

1.5交集靶点PPI互作网络构建

将冬虫夏草与糖尿病肾病的交集靶点上传到STRING 10.0(https：//string-db.org/cgi/input.pl)数据库，将物种选择为“homo sapiens”，构建出冬虫夏草与糖尿病肾病交集靶点相互作用网络，从而得出冬虫夏草与糖尿病肾病交集靶点间的相互作用关系。

1.6冬虫夏草与糖尿病肾病交集靶点功能及生物通路分析

为了进一步探究冬虫夏草与糖尿病肾病间交集靶点参与的生物学过程和涉及的信号通路，将冬虫夏草与糖尿病肾病的交集靶点通过R语言插件中的Bioconductor平台数据包中的org.Hs.eg.db对基因进行编码；再使用R语言插件中的stringi,colorspace以及Bioconductor平台中的cluster Profiler,DOSE,pathview三个数据包，进行基因本体(Gene ontology,GO)分析和基于京都基因与基因百科全书(KEGG)信号通路富集分析，并将得出的结果采用可视化分析。

1.7冬虫夏草对治疗糖尿病肾病的成分-靶点-信号通路网络构建

将交集靶点与活性成分的关联信息以及交集靶点信号通路相互作用信息导入Cytoscape 3.7.2软件，建立成分-靶点-通路的信号通路网络。

2、结果

2.1冬虫夏草活性成分的筛选

利用TCMSP分析平台查询出冬虫夏草中活性成分38个，以OB≥30%及DL≥0.05为筛选条件，最终得到7个化合物。利用TCMSP平台中找出各成分对应的靶点信息，冬虫夏草候选化合物的基本信息及各化合物对应的靶点数，见表1。

2.2冬虫夏草与糖尿病肾病的交集蛋白

在TCMSP分析平台查询到的冬虫夏草蛋白，在Gene Cards、CTD、OMIM、TTD四大数据库中查询到糖尿病肾病靶点共2 987个，并通过在线Venny 2.1.0软件(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)绘制韦恩图，冬虫夏草与糖尿病肾病的交集蛋白共41个，见图1，并通过Cytoscape 3.7.2软件构建“疾病-成分-靶点”网络图，见图2。

2.3交集靶点PPI互作网络构建

为了进一步了解冬虫夏草候选化合物作用靶点与糖尿病肾病相关蛋白间的交集蛋白的相互作用关系，将“2.2”项下所得的41个交集蛋白上传至在线STRING 10.0数据库，得出交集蛋白间的相互作用网络，如图3所示。图中共有41个交集蛋白，190条边，每个蛋白的平均度值为9.27。通过核心靶点筛选条件设置为Degree大于7，共筛选出20个靶点，核心靶点及拓扑参数见表2。

2.4冬虫夏草与糖尿病肾病的GO功能及KEGG通路分析

通过R语言插件对冬虫夏草与糖尿病肾病的41个交集靶点进行GO基因本体富集分析和KEGG信号通路富集分析，以P<0.05为基本设置，分析共得到GO条目863条，其中生物过程(biological process,BP)共775条，细胞组成(cell component,CC)27条，分子功能(molecular function,MF)61条，根据的每样条目P值最小的前10名作图，如图4的条形图和图5的气泡图；KEGG信号通路共133条，选取P值最小的前30名作图，如图6的KEGG条形图和图7的KEGG气泡图，同时选取KEGG中部分通路如AGEs-RAGEs、TNF、VEGF、p53等，使用Cytoscape 3.7.2软件构建“化合物-通路-靶点”网络图，见图8。

表1冬虫夏草候选化合物信息

图1冬虫夏草与糖尿病肾病的交集蛋白

表2核心靶点及拓扑参数

图2冬虫夏草与糖尿病肾病“疾病-成分-靶点”网络图

图3冬虫夏草与糖尿病肾病交集靶点相互作用网络

图4冬虫夏草与糖尿病肾病核心靶点GO生物富集分析条形图

图5冬虫夏草与糖尿病肾病核心靶点GO生物富集分析气泡图

图7冬虫夏草与糖尿病肾病核心靶点KEGG通路分析气泡图

3、讨论

糖尿病肾病的发病原因主要是由于糖尿病患者的血糖控制欠佳导致的，其肾脏血管持续高血糖刺激下导致肾小球动脉硬化，进而使患者的免疫力下降，导致治疗难度加大[6]。现代中医学家将糖尿病肾病归为“消渴肾病”的范畴，关于本病的中医病机，不同医家都有各自的见解，但是大多数医家多认为是“本虚标实”之证。本病发生的基础为正气不足，最主要的是先天之气-肾气、后天之气-脾气的不足，脾肾气虚则无力促进水液正常的代谢，无力推动血液运行，从而形成瘀血、痰湿等病理产物，因此本病以脾肾亏虚为本，瘀血、痰湿等邪实为标[7]。冬虫夏草含有多种腺苷、虫草素、虫草酸、麦角甾醇、虫草多糖以及微量元素，具有补肾益肺、秘精益气之功效[8]。相关动物实验表明冬虫夏草能够降低糖尿病肾病大鼠蛋白尿，从而改善肾功能及肾脏组织的相关病理变化[9]。

本研究通过分析冬虫夏草活性成分靶点-网络，发现冬虫夏草中关键化合物主要是花生四烯酸、乙酸芳樟酯、β谷甾醇、胆固醇。其中起主要作用的是花生四烯酸和β谷甾醇。花生四烯酸可对增加血管弹性、酯化胆固醇、改善血液黏度等作用能有效抑制糖尿病肾病患者的进展[10]。β谷甾醇通过调节内皮功能、降低胆固醇、提高氧化应激能力等改善肾功能[11]。

图6冬虫夏草与糖尿病肾病核心靶点KEGG通路分析条形图

图8冬虫夏草与糖尿病肾病的“活性成分”-“通路”-“靶点”

PPI网络结果显示，冬虫夏草治疗糖尿病肾病的关键靶点有半胱氨酸蛋白酶3 (caspase-3,CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase-1,MAPK1)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor、EGF)、应激活化蛋白激酶(JUN)、RELA原癌基因(RELA)等靶点处于冬虫夏草治疗糖尿病肾病关键靶点的核心位置。其直接或间接参与了细胞增殖、代谢、凋亡的过程，延缓了糖尿病肾病的进展。其中CASP3在细胞凋亡中的主要蛋白酶之一，在细胞凋亡蛋白酶级联中起关键作用，故而CASP3可能直接参与了糖尿病肾病细胞的凋亡过程[12]。MAPK1是MAPK信号传导的关键分子之一，其亚族主要包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)等，其直接参与糖尿病肾病细胞的生长、分化及凋亡等整个生物学过程[13]。

GO分析发现冬虫夏草对糖尿病肾病的生物学过程主要体现在对脂多糖、细胞代谢反应以及甾醇转运调节等，同时有细胞膜、线粒体、外膜等密切参与，主要与相关的酶、蛋白质、受体相结合。

KEGG分析得出冬虫夏草治疗糖尿病肾病的信号通路主要通过AGEs-RAGE、TNF、VEGF、p53等信号通路。AGEs-RAGE信号通路，AGEs是指糖尿病患者体内晚期的糖基化终末产物，通过与其受体(receptor of AGEs,RAGE)结合，从而产生一系列的病理编号，是糖尿病肾病发生发展最为重要的环节。AGEs-RAGE信号通路[14,15]一方面可以激活NF-κb，导致大量黏附分子和促炎因子释放，如IL-6、IL-8和TNF-α，从而导致糖尿病肾病的组织损失和慢性细胞的活化；另一方面可刺激足突细胞的VEGF，诱导血管新生，导致血管通透性增加，诱发蛋白尿。

VEGF信号通路可直接影响肾小球滤过的功能，并进一步加重糖尿病肾病的进展。足细胞所产生的VEGF能有效维持肾小球的结构和功能，VEGF降低可导致蛋白尿、肾小球损伤、系膜增生、基膜增厚等一系列DN的病理改变[16,17]。袁明霞等[18]发现冬虫夏草可通过降低糖尿病肾病的肾组织VEGF的表达，改善慢性缺氧和血管内皮损失，从而改善肾功能、抑制糖尿病肾病的进展。

p53是重要的抗细胞凋亡的基因，直接参与糖尿病肾病中肾小管上皮细胞衰老病理改变[19,20]。临床研究发现冬虫夏草可以通过抑制p53的表达，降低肾小管上皮细胞的凋亡，减少蛋白尿起到肾保护的作用[21]。

TNF是是一种重要的免疫调节细胞因子，也是主要的促炎细胞因子之一，在炎症介导中发挥着重要的作用。目前TNF被认为是在高血糖或糖尿病状态下多种生理病理的改变以及导致DKD共同的最终的中介物质，特别是对微血管的病变具有多样性效应[22,23]。实验研究表明冬虫夏草可以通过下调TNF的炎症因子转录，起到肾保护的作用[24]。临床试验研究也表明冬虫夏草可以从免疫干预、抑制肾脏纤维化，减轻滤过膜压力起到肾保护作用，延缓糖尿病肾病的进展[25]。

综上所述，基于网络药理学分析认为冬虫夏草中的可能通过花生四烯酸、乙酸芳樟酯、β谷甾醇、胆固醇作用于AGEs-RAGE信号通路、P53信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路等通路作用于CASP3、MAPK1、NOS3等靶点，发挥抗炎、抗氧化、增加血氧饱和度等作用。因此，冬虫夏草通过“多成分-多靶点-多通路”的共同作用治疗糖尿病肾病。鉴于网络药理学的局限性，后期还需进一步对冬虫夏草的潜在活性成分、作用靶点及通路进行实验验证。

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