糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病严重并发症之一，是慢性肾脏病变的一种重要类型。DN通常起病隐匿，早期以微量蛋白尿、水肿、高血压为主要临床表现，后期随着肾功能进行性下降可演变为终末期肾脏病甚至死亡。国际糖尿病联合会预测，到2040年，20～79岁糖尿病患者将增至6.42亿[1]，随着全球糖尿病患病率上升，DN发病率也迅速增长，已成为世界范围内最重要的公共卫生危机之一[2]。目前，DN西医治疗指南逐渐完善，主要通过生活方式干预、控制基础疾病、阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统等措施延缓肾损害进展[3]，但不能从根本上治愈DN，其发病机制也尚未阐明。因此，探寻DN的有效靶标并对其进行干预是目前医学研究的重要课题之一。近年来，随着中医药研究的逐渐深入，研究成果逐渐丰富，中药复方在治疗糖尿病及其并发症方面展现出独特优势。

芪丹饮是广州医科大学附属中医医院内分泌科创制并广泛应用于临床治疗DN的基础方，由黄芪、党参、熟附子、山萸肉、熟地黄、丹参、白花蛇舌草、玉米须、益母草、大黄组成，方中黄芪、党参、熟附子共为君药，益气温阳补肾；熟地黄、山萸肉滋阴补肾，玉米须、白花蛇舌草、大黄利水泄浊，共奏补中有泄功效；益母草、丹参活血化瘀、利尿消肿。该方主治DN气虚血瘀、脾肾阳虚等证，具有益气温阳、活血泄浊功效。多年临床实践表明，该方在延缓DN进展、维持肾功能、减少蛋白尿等方面效果显著。此外，临床研究发现，其可参与氧化应激反应、炎症反应、调节免疫功能等生物过程[4]。可见芪丹饮的临床价值及药理作用值得深入研究。

随着各种生物学数据库和计算机生物技术的开发推广，包括网络药理学、分子对接在内的多种方法被广泛用于中医药探索并迅速发展。网络药理学的核心是从多个成分、多个作用靶点、多条通路揭示药物干预疾病的途径[5]，和中医强调从“整体观念”认识疾病的特点有高度相关性。本研究运用网络药理学和分子对接方法，探讨芪丹饮干预DN的机制，为今后DN的新药开发及药理学研究提供理论依据。

1、资料与方法

1.1 有效成分筛选及靶点获取

在TCMSP数据库分别以黄芪、丹参、党参、益母草、山茱萸、熟地黄、附子、玉米须、大黄、白花蛇舌草为关键词检索，初步获取各中药的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件[6]筛选潜在有效成分，并在此数据库查找潜在成分对应的靶点蛋白名称，借助Uni Prot数据库将有效成分对应的靶点蛋白名称转化为标准基因名称。

1.2 糖尿病肾病相关靶点获取

以“diabetic nephropathy”为检索词，分别在Dis Ge NET Durg Bank、Gene Cards、OMIM 、TTD数据库检索DN相关靶点，由于Gene Cards数据库获得靶点较多，靶点Relevance score在0.28～187.38，选取Relevance score大于中位数的靶点为DN潜在靶点，整合去重后，通过Uni Prot数据库将靶点名称统一规范为基因名称。

1.3 芪丹饮-有效成分-交集靶点-疾病网络构建

借助Venny2.1.0 作图工具，分别导入芪丹饮潜在有效成分靶点和DN相关靶点，获得二者交集靶点。在Excel2016中准备“Network”“Type”文件，导入Cytoscape3.9.1构建芪丹饮-有效成分-交集靶点-DN网络，并利用Analyze Network分析功能进行网络拓扑分析。

1.4 蛋白相互作用网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点输入STRING数据库，选择“Multiple proteins”,Organism选择“Homo sapiens”,minimum required interaction score设置为<0.4，其余选项保持系统默认，根据分析结果获得蛋白相互作用（PPI）网络及TSV格式文件，将TSV文件导入Cytoscape3.9.1，点击“Analyze Network”进行拓扑分析，筛选出同时满足度值、中介中心性（BC）、紧密中心性（CC）均大于各自中位数的靶点，即可认为是芪丹饮干预DN的核心靶点。

1.5 核心靶点GO和KEGG通路富集分析

将“1.4”项所得核心靶点输入DAVID数据库，进行GO和KEGG富集分析，根据Count值筛选符合条件的GO富集结果（包括生物过程、细胞组分、分子功能），根据P值筛选出关键通路，并在微生信工具中绘制GO富集柱状图和KEGG气泡图。

1.6 分子对接验证

在TCMSP数据库下载度值排名前6位成分的3D结构并保存为mol2格式，用Py MOL2.6.0软件加氢处理后保存为Pdb格式，在Auto Duck Tools 1.5.7中输出为Pdbqt文件（小分子配体文件）；根据物种多样性、是否有残基等六大原则[7]，在RCSB PDB数据库获取度值排名前6位靶点的晶体结构，用Py MOL2.6.0软件去除水分子和小分子配体后保存为Pdb文件，在Auto Duck Tools 1.5.7中经加氢、计算电荷数、分配AD4类型处理后输出为Pdbqt格式（大分子受体文件），然后使用Auto Duck Grid工具调整并记录对接活性口袋参数，最后通过Auto Duck Vina1.1.2进行分子对接，根据对接结合能绘制热图，并将结合能最小的3个结果在Py MOL2.6.0软件进行可视化处理。

2、结果

2.1 芪丹饮有效成分和作用靶点

剔除TCMSP数据库中无对应靶点的成分，整合去重后共得到芪丹饮有效成分125个，其中黄芪17个、丹参58个、党参17个、益母草8个、山茱萸14个、熟地黄2个、附子6个、玉米须8个、大黄10个、白花蛇舌草5个，各中药部分有效成分信息见表1,12个共有成分信息见表2。剔除在Uni Prot数据库中无对应基因名称的靶点，整合去重后共获得潜在作用靶点277个。

2.2 疾病靶点及交集靶点获取

Dis Ge NET数据库获得疾病靶点566个、Durg Bank数据库43个、Gene Cards数据库1 629个、OMIM数据库541个、TTD数据库中22个，合并去重后共有DN靶点2 309个。利用Venny2.1在线作图工具进行映射，得到交集靶点162个。

2.3 芪丹饮-有效成分-交集靶点-疾病网络构建及拓扑分析

通过Cytoscape软件构建芪丹饮-有效成分-交集靶点-DN网络，将无对应靶点的成分剔除，并进行拓扑分析，结果见图1。共得到288个节点、1 634条边，平均度值8.16，由图可知，A1（槲皮素）、B1（木犀草素）、A3（豆甾醇）、C2(β-谷甾醇）、D3（山柰酚）、HQ10（芒柄花素）可能是芪丹饮治疗DN的主要有效成分。  

表1 芪丹饮部分有效成分信息    

表2 芪丹饮所含药物共有成分信息  

图1 芪丹饮-有效成分-交集靶点-DN网络  

2.4蛋白相互作用网络及核心靶点

利用STRING数据库得到交集靶点PPI网络，见图2。拓扑分析结果显示，该网络包含162个节点、3 508条边，平均度值43.309，图中节点越大、颜色越深，线条越粗代表度值越大，由图可知，AKT1、TNF、IL6等节点在此网络中最为重要。以同时满足度值>39、BC>0.004 9、CC>0.654为条件，共筛选出21个核心靶点，度值排名前6位的靶点为AKT1、TNF、IL6、VEGFA、IL1B、TP53。

2.5 核心靶点GO和KEGG通路富集分析结果

共得到GO富集分析条目101个，其中生物过程（Biological process)77个，主要涉及基因表达、基因转录、炎症反应、血管内皮生成等；细胞组分（Cellular component)8个，涉及复合物、染色质、细胞外空间、细胞外区等；分子功能（Molecular function)16个，涉及转录因子结合、酶结合、蛋白质结合、染色质结合等。分别按Count数降序排列，取各项前12个条目（细胞组分共8个）绘制柱状图，见图3。

以P<0.01和Benjamini<0.01为筛选条件，得到KEGG通路88条，P值最小的为癌症通路，富集基因数最多的为脂质和动脉粥样硬化，其他通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路及TNF、IL-17、MAPK信号通路，选择P值最小的前20条通路绘制气泡图，见图4。

图2 芪丹饮治疗DN交集靶点PPI网络  

图3 芪丹饮治疗DN核心靶点GO富集分析柱状图   

2.6 分子对接结果

将槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、芒柄花素分别与AKT1(PDBID:3CQU）、TNF(4CNI）、IL6 (7KPB）、VEGFA (4ZFF）、IL1B(4DEP）、TP53(6GGC）进行分子对接，对接结合能热图见图5。结合能<0 kcal/mol表明受体与配体具有亲和力，且亲和力紧密程度与结合能呈负相关，若结合能<-5.0 kcal/mol，表明受体与配体高度结合[8]。本次分子对接共进行64次，结合能均小于-6.2 kcal/mol，说明各成分与核心靶点作用紧密。利用Py MOL软件将结合能最低的3次对接结果进行可视化处理，见图6。

图4 芪丹饮治疗DN核心靶点KEGG通路分析气泡图  

图5 关键成分与核心靶点分子对接结合能热图（kcal/mol)  

图6 关键成分与核心靶点分子对接示意图  

3、讨论

DN继发于糖尿病，可转归为肾脏疾病，故可归属于中医学“消渴病”合并“水肿”“尿浊”“关格”“下消”等范畴[9]。DN病因病机复杂，临床治疗以整体观念、标本兼治为原则，根据病情所处的不同阶段辨证论治是关键。陈丽兰等[4]研究表明，芪丹饮联合缬沙坦胶囊可显著降低DN患者血清炎症因子水平，伊娜等[10]研究发现，芪丹饮在改善DN患者血脂指标、抗氧化、改善血液流变学方面优于福利辛片，但具体机制尚不明确。

芪丹饮有效成分较多，由图1可知，槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、芒柄花素可能为芪丹饮治疗DN的关键有效成分。DN发病机制复杂，其中炎症反应、肾小球硬化和转化生长因子（TGF)-β1介导的肾小管间质纤维化是核心环节[11]。槲皮素可抑制NF-κBp65/TGF-β1/CTGF等通路表达起到抗炎作用，从而延缓肾纤维化进展[12]。木犀草素可通过上调Npsh2蛋白表达、抑制STAT3信号通路，抑制炎症反应和氧化反应[13]。芒柄花素可上调Sirt1蛋白表达，激活Nrf2/ARE信号通路，抑制高糖诱导的超氧化物过量产生，防止肾性炎症及纤维化进展[14]。豆甾醇具有保护细胞膜、降低胆固醇功效，β-谷甾醇可通过改善胰岛素水平、降脂、抗氧化等途径防止糖尿病发展[15]。山柰酚可抑制高糖状态下肾小管和肾小球上皮细胞Rho A激酶激活，抗肾小管上皮细胞RPTEC氧化应激，降低肿瘤坏死因子（TNF)-α、白细胞介素（IL)-1β等炎症因子和活性氧（ROS）水平，逆转TGF-β1和结缔组织生长因子（CTGF）表达，起到保护肾小球和防止肾纤维化的功能，进而保持肾功能稳定，预防终末期肾脏病发生[16]。可见，芪丹饮中槲皮素、木犀草素、豆甾醇等有效成分可通过抑制炎症反应、抗氧化应激，从而发挥治疗DN作用。

PPI网络分析结果和富集结果显示，芪丹饮可能作用于AKT1、IL6、TNF、VEGFA、IL1B等靶点，参与调控脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、IL-17、TNF、MAPK信号通路，涉及细胞因子介导、基因表达、转录，细胞增殖，血管生成等多个生物过程。AKT基因家族参与调控胰岛素抵抗、炎症反应、细胞凋亡等生物过程[17],AKT1可调控TGF-β1诱导的细胞外基质的生成、肾小管上皮细胞损伤、足细胞丢失等分子过程[18]，而TGF-β1上调受AGE-RAGE通路的调控[19]。我们推测，芪丹饮作用于AKT1靶点，进而激活AGE-RAGE通路，调控下游靶点活性，发挥抗炎作用。研究发现，炎症反应在DN发生演变过程中发挥关键作用[20]。IL6、IL1B、TNF均属于炎症细胞因子，IL-6信号转导可诱导足细胞损伤、肾小球基底膜增厚，参与系膜和肾小管细胞炎症反应[21];IL1B在DN肾组织炎症反应过程中与IL6有密切相关性，若两者表达同时升高，会加重肾脏结构和功能损害程度，缩短DN发展为终末期肾脏病的时间[22]。研究表明，TNF-α、NF-κB等炎症通路激活后，能和T淋巴细胞协同作用诱导和分化炎症细胞，促进肾脏毒性细胞的基因表达[23]，因此，抑制炎症反应可能是芪丹饮治疗DN的关键靶标。DN作为糖尿病微血管并发症之一，血液流变学异常在其病程进展中发挥重要作用。VEGFA可参与调节血管新生，主要通过促进毛细血管、成纤维细胞广泛增殖和分化，改善糖尿病患者微血管病变[24]。Huang等[25]研究发现，调控VEGFA表达可减轻小鼠肾损伤后出现的毛细血管损伤和纤维化。研究表明，MAPK信号通路介导肾组织多项病理进程，激活炎症反应、氧化、纤维化等病理机制[26]。Woznowski等[27]研究表明，MAPK抑制剂可舒张DN模型大鼠肾小球动脉压力，改善肾脏血流动力学；王兴红等[28]发现，槲皮素通过抑制MAPK信号通路传导，降低大鼠血清炎症、氧化因子水平，从而延缓肾损害。由此可见，芪丹饮在治疗DN过程中，MAPK信号通路发挥重要调节作用。

至于癌症、脂质和动脉粥样硬化、人类巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等通路与DN的关系目前很少有文献报道，但根据富集的靶点信息，推测其在DN进展中也发挥了一定作用，也表明芪丹饮具有治疗其他相关疾病的潜在价值，有待深入研究。

综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接技术阐释芪丹饮治疗DN的作用机制，结果表明，槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、芒柄花素是芪丹饮中关键成分，作用于AKT1、IL6、TNF、VEGFA等核心靶点，调控AGE-RAGE、IL-17、TNF、MAPK等信号通路，涉及多个生物进程。同时分子对接也验证了筛选出的关键成分和核心靶点之间较强的亲和力，初步揭示了芪丹饮通过多成分、多靶点、多通路治疗DN的特点。

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基金资助:广州市中医药临床核心技术建设项目(2022年);

文章来源:杨娜,李慧枝,王文英,等.基于网络药理学和分子对接探讨芪丹饮治疗糖尿病肾病作用机制[J].中国中医药图书情报杂志,2024,48(04):54-60.