恙虫病是一种由恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,Ot)引起的急性感染性疾病,又名丛林斑疹伤寒,人群普遍易感,是广泛流行于热带以及亚热带地区的一个严重的公共卫生问题[1]｡据统计,全球每年报告约有100万新发恙虫病病例,全球有近10亿人深受该病困扰[2]｡恙虫病的传播途径主要为恙螨叮咬,鼠类是恙螨寄生的常见宿主｡该病潜伏期一般为5~21d,多数恙虫病患者症状较轻,对大环内酯类､四环素类抗生素敏感,治疗后数日即可痊愈[3,4]｡但由于本病临床表现各异且检测手段有限,常因误诊或漏诊延误最佳治疗时机,导致病情进展,可引发急性肝肾衰竭､急性呼吸窘迫综合征､脑膜脑炎､感染性休克等重症恙虫病,导致患者住院时间明显延长,病死率显著升高[5,6]｡肝脏损害是恙虫病的常见并发症｡研究表明[7],Ot进入人体后在体内迅速生长繁殖并产生大量毒素,引起广泛性小血管炎,导致肝细胞发生炎性反应,肝细胞膜破裂,最终导致肝功能受损｡免疫损伤一直被视为恙虫病的重要致病机制[7]｡T淋巴细胞亚群､调节性T细胞(Tregs)作为机体免疫应答的主要参与者,在维持体内免疫环境的稳态和诱导免疫耐受的形成中发挥着关键作用,理论上其在恙虫病的发生､发展乃至病情演变中均可能存在某种作用｡但现阶段有关T淋巴细胞亚群､Tregs在恙虫病患者病程中的研究报道十分少见,其具体作用机制仍未阐明｡故本研究检测51例恙虫病合并肝损害患者及20名健康对照人群的外周血T淋巴细胞亚群､Tregs的比例,观察恙虫病合并肝损害患者的免疫状态,初步探讨T淋巴细胞亚群､Tregs在恙虫病合并肝损害中的作用,以期为恙虫病的防控提供科学依据｡

一､资料与方法

1.一般资料:

选择2022年10月—2023年12月本院收治的恙虫病合并肝损害患者51例作为研究组,其中男27例,女24例;年龄22~83岁,平均(62.46±15.48)岁;体质量指数(BMI)20.19~26.90kg/m2,平均(23.71±1.50)kg/m2｡

纳入标准:(1)临床明确诊断为恙虫病合并肝损害;(2)成年患者,性别不限;(3)临床资料完整｡

排除标准:(1)未在我院完整治疗,中途更换医院者;(2)合并原发心､肺､肝､肾功能疾病者;(3)有激素药物服用史;(4)精神或认知障碍;(5)其他原因引起的肝功能指标异常者｡另收集同期于本院体检的健康人20名作为对照组,男12名,女8名;年龄24~80岁,平均(61.59±16.30)岁;BMI19.54~26.53kg/m2,平均(23.58±1.33)kg/m2｡两组性别､年龄､BMI等一般资料均衡可比(P>0.05)｡此项研究经本医院医学伦理委员会审批同意后开展｡

2.诊断标准:

恙虫病的诊断参考我国恙虫病临床诊疗专家共识[8]:(1)流行病学史流行季节,发病前3周内曾在或到过恙虫病流行区,并有野外活动史､草地坐卧史等;(2)发热;(3)淋巴结肿大或者皮疹,或者特异性焦痂或溃疡｡同时满足以上3项即可临床诊断恙虫病,或者无典型流行病学病史但是在流行季节出现了发热和特异性的焦痂或溃疡｡恙

虫病合并肝损害的诊断参考如下[9]:(1)符合恙虫病诊断标准;(2)排除因病毒性肝炎､酒精性肝炎､自身免疫性肝炎等原发存在的肝脏疾病所致的肝损害;(3)血清ALT､AST高于正常上限;(4)B超可见肝损害表现;(5)伴或不伴厌食､纳差､呕吐､腹胀等消化道症状｡具备前3项即可确诊｡

3.方法:

(1)外周血T淋巴细胞亚群､调节性T细胞(Tregs)检测空腹状态下,抽取两组肘静脉血4ml,采用常规技术Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMCs),采用流式细胞术,CD3+CD4+抗体标记的为CD4+T细胞,CD3+CD8+抗体标记的为CD8+T细胞,CD4+CD25+CD127-标记为Tregs细胞｡以FC-500-MCL/MPL型流式细胞仪(美国BECKMAN公司)观察并记录CD4+T､CD8+T细胞､CD4+CD25+CD127-Tregs细胞(以下简称Tregs细胞)的计数及所占百分比｡(2)肝功能检测:收集本院生化室肝功能检测结果,具体为取上述血样,采用Cobas8000全自动生化分析仪(德国罗氏公司)及其配套试剂测定ALT､AST､TBIL等指标的血清水平｡(3)研究组分组方法:本项研究根据研究组患者肝损害ALT>4ULN(upperlimitofnormal,正常上限值)或AST>4ULN或TBIL>2ULN评分结果[10],将符合上述任何一条标准的患者纳入重症组(n=21),肝损害不符合上述任何一条标准的患者纳入非重症组(n=30)｡

4.统计学处理:

应用SPSS25.0统计学软件进行数据处理,计量资料均符合正态以(x±s)表示,比较用t检验;计数资料以[n(%)]表示;外周血T细胞亚群､Tregs与肝功能指标之间的相关性采用Pearson相关性分析;外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平单独及联合对恙虫病合并重度肝损害的预测效能采用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析｡以P<0.05为差异具有统计学意义｡

二､结果

1.研究组与对照组外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平比较:

研究组CD4+T细胞､CD8+T细胞､Tregs细胞计数分别为(137.35±30.21)个/μl,(169.70±39.32)个/μl,(4.10±1.01)个/μl,对照组相应T细胞计数分别为(40.75±4.43)个/μl,(25.28±3.89)个/μl,(6.01±1.38)个/μl,研究组CD4+T细胞､CD8+T细胞计数均高于对照组,Tregs细胞计数明显低于对照组(P<0.05)｡见表1｡

表1研究组与对照组外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平比较

2.研究组与对照组肝功能指标比较:

研究组和对照组ALT､AST､TBIL水平分别为(114.27±36.01)U/L､(124.51±25.17)U/L､(41.60±15.31)μmol/L､(27.51±5.30)U/L､(31.29±3.72)U/L､(15.19±3.50)μmol/L,研究组ALT､AST､TBIL水平均显著高于对照组(P<0.05)｡见表2｡

表2研究组与对照组肝功能指标比较

3.研究组外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平与肝功能指标的相关性:

Pearson相关性分析显示,研究组外周血CD4+､CD8+T细胞比例与其ALT､AST､TBIL等肝功能指标均呈正相关,而Tregs细胞比例与ALT､AST､TBIL水平呈负相关(P<0.05)｡见表3｡

表3研究组外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平与肝功能指标的相关性

4.研究组不同病情患者血外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平比较:

重症组外周血CD4+､CD8+T细胞比例均高于非重症组,Treg细胞比例低于非重症组(P<0.05)｡见表4｡

表4重症､非重症患者血外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平比较

5.外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平对恙虫病合并肝损害患者重症进展的预测效能:

ROC分析显示,CD4+､CD8+T细胞及Treg细胞单独预测恙虫病合并肝损害重症进展的AUC均>0.7,此三项联合AUC可提升至0.894,高于CD4+T细胞､CD8+T细胞､Treg细胞单独预测(Z联合vsCD4+T细胞=2.257､Z联合vsCD8+T细胞=2.934､Z联合vsTreg细胞=2.098,均P<0.05)｡见表5､如图1｡

表5外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平对恙虫病合并重症肝损害的预测效能

图1外周血T淋巴细胞亚群､Tregs单独及其联合预测恙虫病合并肝损害重症进展的ROC曲线

3､讨论

作为一种由Ot引起､恙螨幼虫叮咬导致的自然疫源性传染病,近年来恙虫病的发病率在全球各地逐年增长,世界范围内恙虫病的流行区域明显扩大,这与社会经济发展､气候变化以及全球经济贸易人口交流提高等因素密切相关,尤其是农业种植以及水果产业的发展,以及户外活动(如钓鱼､野炊等)的流行,增加了恙虫病患病的风险[11]｡目前有关恙虫病的病理生理学机制尚未完全明确,比较一致的观点是,Ot从淋巴系统进入血液,在血管内皮细胞､单核及巨噬细胞内生长､繁殖,并不断释放毒素,形成广泛的小血管炎,最终导致各器官功能出现不同程度损害,其中以肝损害最为常见,发生率可达高达90%[12]｡尽管现阶段已陆续有研究证实了细胞免疫以及体液免疫功能紊乱在恙虫病发生､发展中的关键作用,但针对恙虫病合并肝损害患者外周血T淋巴细胞亚群､Tregs表达水平变化及其临床意义的研究甚少｡为进一步揭示恙虫病合并肝损害的免疫机制,本研究从外周血T淋巴细胞亚群､Tregs入手,探讨其表达水平在恙虫病合并肝损害病程中的作用及临床意义,为此类疾病的临床诊疗提供指导｡

外周血T淋巴细胞亚群在机体免疫调节中扮演着重要角色,它们不仅介导细胞免疫反应,还维持机体内环境平衡｡T淋巴细胞根据其表型和功能主要分为辅助性T细胞(以CD4+T细胞为代表)和细胞毒性T细胞(以CD8+T细胞为代表)｡辅助性T细胞在抗原刺激后通过分泌细胞因子(如白细胞介素-2､4､5､12､干扰素-γ等)和表达的表面分子调节免疫系统中其他细胞的生物活性,介导免疫反应的启动及最终表现形式,辅助细胞毒性T细胞分化,调节抗病毒免疫应答｡调节性T细胞(Tregs),通常表达CD4+CD25+FoxP3+,通过分泌细胞因子如TGF-β和IL-10等,抑制过度的免疫反应,维持免疫耐受,它最主要的功能是直接杀伤靶抗原,参与清除机体病原体感染､抗肿瘤免疫以及介导器官移植排斥反应,促进T细胞活化[13,14]｡除上述细胞外,Treg也是维持机体正常免疫功能的另一类重要细胞,其通过分泌免疫抑制因子,如白细胞介素-10､35､生长转化因子-β等,对效应T淋巴细胞产生抑制作用,近年来,其在恶性肿瘤的免疫治疗中备受瞩目[15]｡正常情况下,机体各T淋巴细胞亚群保持一定的数量和比例,以维持机体正常免疫功能｡当其数量及比例失衡,机体便会因免疫紊乱而产生一系列病理变化｡本研究显示,研究组CD4+､CD8+T细胞比例均高于对照组,Tregs细胞比例明显低于对照组,这与此前王强等[16]报告恙虫病组患者CD4+T淋巴细胞､CD8+T淋巴细胞水平均较健康对照组更高相吻合,提示与健康人群相比,恙虫病合并肝损害患者存在明显的免疫损伤,临床可将外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞检测作为区分恙虫病合并肝损害患者及健康人群的有效指标｡分析恙虫病合并肝损害患者外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞比例发生变化的原因可能是:Ot感染后,会系统扩散至大量器官,引发各个器官特异性炎症,产生白介素-1､2､3､10､肿瘤坏死因子-α､干扰素-γ等细胞因子,引起Th､Ts细胞反应,导致淋巴细胞增多;另一方面,为抵抗Ot,机体固有性､特异性免疫应答被激活,加速T细胞的分化及增殖,在此种病理状态下,患者外周血CD4+T淋巴细胞､CD8+T淋巴细胞比例随之升高,Treg细胞比例随之降低[17]｡而合并肝损害可刺激相关免疫细胞激活并释放大量促炎因子,T淋巴细胞亚群､Treg细胞的紊乱程度[18]｡

ALT､AST､TBIL均为目前临床常用的肝功能评价指标｡其中ALT与AST均为非特异性细胞内功能酶,二者在正常情况下血清含量较低(通常<40U/L),当肝脏受损,肝细胞膜的通透性增强,这两种酶会由细胞内逸出,使ALT､AST的血清含量大幅升高[19]｡TBIL主要由肝脏处理,其被肝脏摄取,并在肝脏内与葡萄糖醛酸结合,形成结合总胆红素,最后同胆汁一起进入毛细胆管并排出体外,因此,当患者出现肝脏损害时,也可导致血清TBIL水平异常升高[20]｡本研究中,研究组ALT､AST､TBIL的血清水平均高于对照组,证实恙虫病合并肝损害患者肝功能指标均呈现异常,临床应在此类患者中对上述常见指标进行跟踪监测,以便及时了解患者肝功能的变化情况｡本研究采用Pearson相关性分析法评估恙虫病合并肝损害患者外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞表达水平与肝功能指标之间的关系,结果显示,研究组外周血CD4+､CD8+T细胞比例与其ALT､AST､TBIL均呈正相关,而Tregs细胞比例与ALT､AST､TBIL水平呈负相关｡考虑原因可能与外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞水平的波动,可通过影响恙虫病患者的自身免疫应答水平,参与其肝功能损伤有关[21],该研究结果亦提示外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞水平可一定程度反应恙虫病患者的肝功能损害程度,对患者病情进展评估具有重要的参考价值｡杨东等[22]的研究结果亦显示,随着肝功能损害程度加重,淋巴细胞计数进一步增加,多因素分析显示淋巴细胞计数升高(OR=3.457)是恙虫病引起肝功能中重度损害的独立危险因素,本研究结果与之相符｡另外,本研究显示,重症组外周血CD4+､CD8+T细胞比例均较非重症组升高,而Treg细胞比例较非重症组明显降低,进一步绘制ROC曲线评估其应用价值,发现CD4+､CD8+T细胞及Treg细胞单独预测重症肝损害进展的AUC均>0.7,此三项联合AUC可提升至0.894,可见外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞水平可有效地对恙虫病合并肝损害患者重症进展状态进行预测,指导临床病情评估以及预后判断｡本研究的不足之处在于样本量相对有限,且主要分析为不同程度肝损害患者外周血T淋巴细胞亚群､Treg细胞比例之间的差异,综合病情评分指标如APACHEⅡ评分T淋巴细胞亚群､Treg细胞指标之间的相关性值得进一步深入探究,该项研究后续仍需开展多中心､大样本研究进行深入论证｡

综上所述,恙虫病合并肝损害患者患者外周血CD4+､CD8+T细胞比例明显升高,而Treg细胞比例明显降低,且其表达水平与其肝功能之间具有较强的相关性;T淋巴细胞亚群CD4+､CD8+T细胞及Treg细胞对恙虫病合并重度肝损害具有良好的预测价值,有助于对患者的病情及预后进行评估｡

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基金资助:蚌埠医学院自然科学重点项目(2021byzd084);

文章来源:张良杰,汪小玲,陈慧娟,等.外周血T淋巴细胞亚群､Tregs在恙虫病合并肝损害患者中的水平及其临床意义[J].齐齐哈尔医学院学报,2025,46(11):1025-1029.