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基于网络药理学方法对溃疡性结肠炎实施葛根芩连汤治疗的作用机制

2020-06-16 713 上传者：管理员

摘要：[目的]:运用网络药理学方法对葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制进行研究。[方法]运用TCMSP数据库获取葛根芩连汤有效成分及预测药物作用靶点;运用CTD数据库获取UC疾病基因;运用STRING在线工具构建蛋白互相作用网络;使用Cytoscape3.7.1软件进行蛋白网络可视化处理,运用cytoHubba、MCODE插件筛选关键基因;使用WebGestalt工具进行基因本体及KEGG信号通路分析。[结果]葛根芩连汤靶点与UC疾病的交集基因共112个,功能涉及细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质磷酸化、细胞膜、转录因子等方面;KEGG信号通路结果显示交集基因富集于免疫调节密切相关的Th17细胞分化、IL-17信号、肿瘤坏死因子信号通路、与缺氧相关的低氧诱导因子-1信号通路、肿瘤相关的癌症的途径、结直肠癌通路和PI3K-Akt信号通路;筛选得共10个关键靶点基因,这些基因与免疫反应、肿瘤密切相关。[结论]葛根芩连汤治疗UC的机制是多靶点、多通路的复杂过程,其机制与调节免疫反应、缺氧反应、抗肿瘤等相关通路有关。

关键词：
慢性炎症
治疗
消化内科
溃疡性结肠炎
网络药理学
葛根芩连汤
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溃疡性结肠炎是一种黏膜慢性炎症性和溃疡性病变,常累及直肠、结肠,主要表现为腹痛、腹泻、黏液血便和里急后重等症状,具有复发和缓解的特点[1]。目前认为UC是在遗传易感性基础上,受环境和肠道菌群影响的一种肠道免疫异常,临床常用药物包括氨基水杨酸类、激素和免疫抑制剂等,但药物抵抗、药物依赖及不良反应等问题限制了这些药物的临床使用。

葛根芩连汤出自《伤寒论》,具有解表清里、升清止利的功效,用以治疗协热下利,是治疗UC大肠湿热证的经典方剂之一。葛根芩连汤治疗UC具有显著的临床疗效[2,3]。在机制研究方面,葛根芩连汤具有抗炎、抗氧化、抗病原微生物等药理作用[4],但这些研究大多针对单一的蛋白或信号通路进行研究,具有一定局限性。网络药理学是一种新兴的中药复方研究方法,对中药复方多种有效成分进行整体研究,能挖掘复杂处方的潜在作用机制。本文拟运用网络药理学技术,对葛根芩连汤治疗UC的作用机制进行研究,现报道如下。

1、资料与方法

1.1葛根芩连汤有效化学成分及标靶获取

运用TCMSP2.3数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)获取葛根芩连汤的化学成分及其作用的靶点,根据ADME算法,取口服利用度(OB)≥30%,分子相似性(DL)≥0.18的有效成分进行后续分析。

1.2UC疾病标靶获取

检索CTD数据库(http://ctdbase.org)获取UC疾病基因,取相关性大于15的基因用于分析。

1.3中药-作用靶点-疾病互作网络构建及关键基因筛选

将药物标靶基因和UC疾病基因取交集作为中药标靶-疾病交集基因,将交集基因导入STRING(https://string-db.org/)在线工具构建蛋白互作(PPI)网络。运用Cytoscape3.7.1软件进行蛋白互作网络可视化,构建葛根芩连汤对治疗UC的直接或间接作用靶点生物学网络。使用cytoHubba及MCODE插件筛选关键基因。运用cytoHubba插件的MMC算法计算基因核心度,选取MMC分数前10的基因。使用MCODE插件,将K-Core设置为2,聚类得的3个核心模块,两者交集认为是葛根芩连汤治疗UC的关键基因。

1.4基因本体分析

运用WebGestalt在线工具(http://www.webgestalt.org/)进行基因本体(GO)分析。将中药标靶-疾病交集基因输入WebGestalt,分别对生物功能、细胞功能、分子功能进行GO富集分析,FDR取≤0.05的GO功能认为是显著富集。

1.5KEGG信号通路富集分析

运用WebGestalt在线工具进行KEGG信号转导通路分析。将交集基因上传至WebGestalt中,选用KEGG信号转导通路数据库进行富集分析,FDR≤0.05的KEGG信号通路认为是显著富集。

2、结果

2.1中药-疾病靶基因预测结果

共获取葛根芩连汤作用标靶基因218个,UC相关基因15193个,获得交集基因112个。

2.2中药-作用靶点-疾病互作网络构建及关键基因筛选

运用Cytoscape软件构建“葛根芩连汤标靶-溃疡性结肠炎疾病”交集基因的互作网络,按照Degree值大小,从大到小标记为红色到黄色,见图1。运用cytoHubba插件对网络中的基因的重要性进行排序,取排名前10的基因为主要基因。运用MCODE对关键基因进行聚类,共获得3个模块,如图2。

图1葛根芩连汤标靶-疾病交集基因蛋白互作网络图

图2葛根芩连汤标靶-疾病交集基因核心聚类

MCODE算法获得的3个模块,与MCC评分最高10个基因交集,得到的10个关键基因分布于3个模块中,分别为MYC、TP53、MAPK14、ESR1、AKT1、STAT3、MAPK1、JUN、FOS、MAPK3。对葛根芩连汤有效成分和关键基因构建互作网络,见图3。

图3葛根芩连汤有效成分和关键基因互作网络

2.3GO分析结果

对112个中药-疾病交集靶基因进行GO分析,取FDR值<0.05并排名前10的基因功能,见表1。

表1葛根芩连汤标靶-疾病交集基因GO分析结果

GO分析结果显示,葛根芩连汤对细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等生物功能,细胞膜、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、蛋白激酶复合物等细胞功能,转录因子结合、转录因子活性直接配体调节序列特异性DNA结合、磷酸酶结合等分子功能均有广泛的调节作用。

2.4KEGG信号转导通路分析结果

对中药标靶-疾病交集基因进行KEGG分析,获得相关信号通路按FDR排序,将前20个信号通路中与UC相关的通路列于表2。

表2葛根芩连汤标靶-疾病交集基因KEGG分析结果

KEGG分析结果显示,葛根芩连汤治疗UC涉及的信号通路主要包括癌症的途径、TNF信号通路、Th17细胞分化、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、结直肠癌、PI3K-Akt信号通路,主要涉及调节免疫反应、抗缺氧、抗肿瘤。

3、讨论

葛根芩连汤出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治》,原文“太阳病,桂枝证,医反下之,利遂不止,脉促者,表未解也;喘而汗出者,葛根黄芩黄连汤主之”,由葛根、黄芩、黄连与炙甘草4味中药组成,主治表证未解、邪热内陷阳明之协热下利[5]。方中葛根升阳止泻,解肌透邪;黄芩、黄连清热燥湿,又能厚肠坚阴止利;炙甘草令诸药调和,共奏清热除湿、升阳止泻之功。现代研究表明,葛根芩连汤能通过降低血浆中IL-18,提高IL-4的表达,减轻炎症反应,并能提高血浆SOD,增加抗氧化作用,从而减少结肠黏膜损伤[4]。

网络药理学是一种基于“疾病-基因-靶标-中药药效分子”模式的新型中药复方研究方法,揭示药物与靶点之间的关联,阐释中药活性成分间“多途径、多靶点”的协同作用机制,为中药复方的生物学效应研究提供理论支持[6]。

本研究葛根芩连汤作用的靶基因和UC疾病基因进行了PPI网络功能注释、GO和KEGG信号通路富集分析,发现葛根芩连汤与调节免疫、抗肿瘤有密切的关联。MCODE算法获得3个模块中的基因与炎症和肿瘤的发生发展有密切关联。通过网络算法,筛选出葛根芩连汤作用的10个关键基因,分别为MYC、TP53、MAPK14、ESR1、AKT1、STAT3、MAPK1、JUN、FOS、MAPK3,均属于参与细胞凋亡及免疫反应的转录因子和细胞因子。GO分析结果显示,葛根芩连汤对细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等生物功能,以及细胞膜、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、蛋白激酶复合物等细胞功能,转录因子结合、转录因子活性直接配体调节序列特异性DNA结合、磷酸酶结合等分子功能均有广泛的调节作用。KEGG分析结果表明,葛根芩连汤主要对免疫反应、抗缺氧、肿瘤等相关通路起调节作用。

葛根芩连汤对UC的治疗作用可能通过以下机制实现。首先,KEGG通路富集分析结果显示,葛根芩连汤可能通过调节Th17淋巴细胞的分化及其相关细胞因子的表达,起到调节免疫反应的作用。目前普遍认为,UC患者存在肠黏膜炎症免疫耐受紊乱,肠黏膜免疫反应异常激活是UC发生、发展的直接因素,Th1/Th2细胞失衡可导致免疫失调和肠道炎症[7]。免疫细胞Th17及其相关细胞因子失衡在UC的发病机制中起重要作用。Th17细胞主要分泌促炎细胞因子IL-17,并能上调TNF-α的表达。IL-17具有强烈的促炎、致炎作用,刺激多种炎性因子的表达[8],TNF-α将循环血中炎症细胞募集至局部组织[9],与IL-17协同放大炎症效应,破坏局部黏膜组织,导致肠黏膜溃疡,可导致UC的发生。在关键基因中,STAT3(Degree=40)高于其他蛋白节点,表明STAT3在葛根芩连汤的PPI网络中处于核心地位,是联通整个PPI网络中其他节点的纽带。STAT3能通过调节幼稚CD4(+)T细胞向Th17细胞或向调节性T细胞的分化,从而调节免疫反应,与上皮细胞再生、增强黏膜屏障完整性有密切关系[10]。其次,葛根芩连汤还可能通过HIF-1信号通路改善组织缺氧。组织缺氧是UC的重要病理改变。UC肠黏膜中性粒细胞聚集,使血小板活化,促进局部血栓形成,导致结肠黏膜微循环障碍,肠黏膜屏障被破坏,而黏膜上皮细胞凋亡和再生等因素进一步影响肠黏膜微循环,使肠组织处于低氧微环境。HIF-1是一种由低氧微环境诱导表达的转录因子,低氧条件下结肠组织发生防御性和保护性反应,诱导HIF-1α表达,调控COX-2等多种靶基因的表达,以调节氧供需矛盾,影响肠黏膜屏障功能的修复和维持[11]。朱燕莉等[12]研究显示,UC患者存在HIF-1α异常高表达,随着病情的进展和肠腔损伤的加重,HIF-1α显著升高。此外,缺氧微环境上调mTOR的表达,从而促进HIF-1α易位进入细胞核以激活Th17,与Th17及IL-17密切相关[13]。

随着病情的进展,UC患者罹患继发性结肠癌的风险增加。在慢性炎症的长期刺激下,病程较长的UC患者可通过“炎症-异型增生-癌变”转化途径继发肠道癌变。TP53是一个重要的抑癌基因,受环境及促炎细胞因子刺激,TP53活化后通过调控细胞应激以调节靶基因的表达,调节细胞周期,促使细胞凋亡,促进DNA修复,从而发挥抑癌作用。PI3K-AKT信号通路中,磷酸化的AKT激活下游的MDM2,进而抑制TP53,诱导UC相关结肠癌病变。另外,在炎症背景下,通过PI3K-AKT信号通路激活NF-κB等癌症关键因子,该通路通过活化IKK,激活NF-κB,扩大炎症反应,增加黏膜损伤[14]。本研究发现,葛根芩连汤可能通过癌症的途径和结直肠癌信号通路抑制这种演变进程。

综上所述,经典方葛根芩连汤治疗UC是多靶点、多通路的复杂过程,可能通过调节免疫反应、缺氧反应、抗肿瘤途径发挥作用。网络药理学研究结果揭示了葛根芩连汤多成分-多靶点-多通路的作用机制,为全面深入阐明葛根芩连汤治疗UC的作用机制提供新思路,为进一步开展相关药理学研究提供科学依据。

参考文献：

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[12]朱燕莉,张海,饶德利.低氧诱导因子-1α和胰岛素样生长因子-I检测在溃疡性结肠炎的临床应用价值[J].中国中西医结合消化杂志,2017,25(2):132-134.