肝纤维化是由各种形式慢性肝病导致的肝脏结缔组织异常增生，其主要病因包括血吸虫和肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病等[1]。如若不进行治疗，肝纤维化可发展成肝硬化和门静脉高压症、肝性脑病和/或肝功能衰竭，最终可能导致器官衰竭和死亡。肝纤维化的机制极其复杂，涉及大量的细胞和分子事件。目前研究认为，在外源性因素的刺激下，位于窦周间隙的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）被激活，转化为肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质，进而导致肝纤维化病变[2]。肝纤维化的发生和发展受到众多信号通路的调节，包括MAPK信号通路、Wnt信号通路、PI3K/AKT信号通路、Hedgehog/Gli信号通路等[3]。因此，通过抑制相关信号通路的激活，进而抑制HSC的活化并诱导其凋亡，是治疗肝纤维化的重要策略[4]。

microRNA(miRNA）是一类由18～25个核苷酸构成的内源性非编码RNA，其通过与靶mRNA的3′-非编码区结合，调控目的基因的表达，进而参与许多复杂的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和癌变等[5]。因此，miRNA介导的RNA干扰作为一种转录水平调控基因表达的新机制，引起了众多研究者的关注。在肝纤维化病程中有许多miRNA参与其中[6]。例如miRNA-29家族的mi RNA-29b通过降低TGF-β/Smad3的激活水平，抑制HSC的活化和肝纤维化的发生[7]。miRNA-34a通过靶向抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员1的表达，调控细胞内脂肪酸的积累，最终抑制HSC的激活[8]。

miRNA-933对HSC的生物学功能及作用机制的研究还未系统报道。因此，本研究通过体外转染技术，将miRNA-933模拟物及其抑制剂转染人肝星状细胞系（LX-2细胞），探讨miRNA-933对HSC生物学功能的影响，为抗肝纤维化治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 材料

如非特殊说明，所有试剂均来自美国SigmaAldrich公司。高糖培养基（DMEM）、特级胎牛血清与磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自美国Gibco公司，减血清培养基（OPTI-MEM）购自美国Hy Clone公司，mi RNA-933分子模拟剂（mi RNA-933 mimic）与抑制剂（mi RNA-933 siRNA）购自上海吉玛制药技术有限公司，LipofectamineTMRNAiMAX、Trizol、RevertAid试剂盒、ECL发光液和RNA反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，CCK-8试剂盒购自美国Promega公司，全RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液和PVDF膜转膜缓冲液购自上海海利克斯公司。兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（货号#4970）、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体（货号#19245）、兔抗人胱天蛋白酶3(Caspase-3，货号#314220）、兔抗鼠多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1，货号#9532）、兔抗人活化转录因子4(ATF4）单克隆抗体（货号#11815）、兔抗人活化转录因子3(ATF3）单克隆抗体（货号#18665）和兔抗人C/EBP同源蛋白（CHOP）单克隆抗体（货号#2895）购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗人胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ，货号#19245）、Kruppel样因子6(KLF6）多克隆抗体（货号#241385）购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

当LX-2细胞培养至合适密度（80%～90%）时，吸弃培养液，加入胰酶消化1 min，随后800×g离心5 min；离心结束后，吸弃上清，重悬细胞，根据细胞数量，将细胞悬液平均分配到2～3个10 cm培养皿中，5%CO2浓度，37℃、饱和湿度，静置培养，隔天观察细胞生长情况。

1.2.2 细胞转染

取生长状态良好的LX-2细胞接种于6孔板中，每孔接入1×106个，待细胞贴壁后，将细胞分为5组。不经任何处理的细胞作为空白对照组（Control组），转染mi RNA-933 siRNA的细胞为敲减实验组（mi RNA-933 siRNA组），转染NC siRNA的细胞为敲减阴性对照组（siRNA-NC组），转染miRNA-933 mimic的细胞为过表达实验组（miRNA-933 mimic组），转染NC mimic的细胞为过表达阴性对照组（mimic-NC组）。细胞转染操作按照LipofectamineTMRNAiMAX说明书进行，6孔板每孔加入转染试剂6µL、mimic(10µmol/L）或si RNA(20µmol/L)3µL,48 h后进行检测。

1.2.3 总RNA提取与反转录PCR

核酸提取方法按照Trizol法进行，反转录按照Thermo反转录试剂盒操作说明书进行，每20µL体系加入RNA模板1 000µg,U6-RT引物1.5µL,mi RNA-933-RT 1.5µL,d NTP 2µL,reaction buffer 4µL,RI 1µL,RT 1µL，剩余不足用水补齐。

1.2.4 基因芯片检测

为明确肝病患者与健康人肝组织中miRNA的表达变化，本研究利用基因芯片技术，检测慢性乙型肝炎与肝硬化患者相较于健康人肝组织中miRNA的表达差异。由北京诺禾致源科技股份有限公司进行基因芯片检测。使用Expression Console软件提取原始探针信号值，通过RMA算法对原始数据进行校正和标准化处理，应用Transcriptome Analysis Console软件分析各组转录本差异。

1.2.5 实时荧光定量PCR(q PCR）检测

使用Trans Start Tip Green qPCR Super Mix进行qPCR检测，反应体系为20µL，反应条件设置为60℃30 s,94℃5 s,58℃30 s，总共设置40个循环，数据采用2-∆∆Ct法进行分析，引物信息见表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western Blot检测

使用江苏凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后分别过夜孵育α-SMA(1∶2 000稀释）、CollagenⅠ（1∶2 000稀释）、Caspase-3(1∶2 000稀释）、PARP-1(1∶2 000稀释）、ATF4(1∶2 000稀释）、ATF3(1∶2 000稀释）、CHOP以及β-actin(1∶5 000稀释）蛋白抗体。

1.2.7 流式细胞术检测凋亡率

按照江苏凯基凋亡/坏死检测试剂盒说明书进行操作，每组细胞处理结束后，消化收集细胞，用500µL binding buffer重悬细胞，每组加入2µL AnnexinⅤ染料，3µL PI染料，37℃避光孵育30 min。离心弃上清，PBS清洗一遍后，用binding buffer重悬细胞，上机检测。

1.2.8 CCK-8检测细胞增殖率

应用江苏凯基CCK-8试剂盒，操作步骤简略如下：将生长状态良好的LX-2细胞每孔1×105个接入96孔板中，贴壁后按照实验设计处理，随后按照每孔溶液体积的1/10加入CCK-8试剂，2 h后利用酶标仪检测450 nm波长下吸光度，以LX-2空白细胞吸光度为参比，计算各组增殖率。

1.2.9 克隆形成实验

取对数期生长的细胞，细胞计数后以每孔1 000个细胞数接种于6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养48 h后，移除培养液，使用40 g/L多聚甲醛固定15 min，随后去除多聚甲醛，加入结晶紫染液复染10 min；流水缓慢洗去染液，显微镜下计数每孔克隆形成数。

1.3 统计学方法

采用Graph Pad Prism 9.0软件进行数据分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，并经过Bonferroni校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肝组织中差异表达miRNA的筛选与验证

基因芯片检测结果如图1a、b所示，肝病患者与健康人肝组织中mi RNA表达谱具有明显差异，根据差异倍数筛选出上调的mi RNA 10个，下调的mi RNA 8个。随后，利用q PCR技术验证芯片结果，如图1c、d所示，筛选获得的18个mi RNA q PCR检测结果与芯片结果保持一致，其中miRNA-933下调最为明显。

2.2 miRNA-933对LX-2细胞活化的影响

为探讨miRNA-933对肝细胞生物学功能的影响，本研究合成miRNA-933的mimic与siRNA，转染入LX-2后利用qPCR检测各组细胞中miRNA-933相对表达水平。结果如图2a所示，miRNA-933 mimic组的miRNA-933相对表达量明显高于mimic-NC组（P=0.000 3);miRNA-933 siRNA组的miRNA-933相对表达量明显低于siRNA-NC组（P=0.000 7),miRNA-933过表达与敲减模型构建成功。

为验证mi RNA-933对LX-2活化的影响，本研究利用q PCR和Western Blot分别检测各组细胞中活化标志物CollagenⅠ和α-SMA的表达情况。结果如图2b～f所示，与si RNA-NC组相比，mi RNA-933 siRNA在核酸和蛋白水平均显著促进α-SMA和CollagenⅠ的表达（P值均<0.001）；另一方面，与mimic-NC组相比，mi RNA-933 mimic显著抑制α-SMA和CollagenⅠmRNA与蛋白的表达（P值均<0.05），推测miRNA-933可抑制HSC的激活。

图1 肝组织中差异表达的miRNA筛选

2.3 miRNA-933对LX-2细胞凋亡的影响

利用流式细胞术结合Annexin V/PI双染法，检测miRNA-933 siRNA组和miRNA-933 mimic组凋亡率变化，结果如图3a所示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调了LX-2细胞凋亡率（P=0.031 9），而miRNA-933 mimic处理后，细胞凋亡率显著升高（P=0.005 5）。进一步通过Western Blot检测各组细胞中抑凋亡关键因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2）和凋亡关键因子Caspase-3/PARP-1的表达变化（图3b），结果与流式细胞术检测结果相符，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调Caspase-3(P=0.006 7）和PARP-1(P=0.003 0）的表达，上调Bcl-2的表达（P=0.002 0），而miRNA-933 mimic显著上调Caspase-3(P=0.011 8）和PARP-1(P=0.049 5）的表达，下调Bcl-2的表达（P=0.002 1）。上述研究结果表明，miRNA-933可促进HSC凋亡。

2.4 mi RNA-933对LX-2细胞增殖的影响

将mi RNA-933转染LX-2后，分别在24、48、72、96 h观察mi RNA-933对各组LX-2细胞增殖的影响。细胞集落形成检测结果表明，与si RNA-NC组相比，mi RNA-933 siRNA组细胞集落显著增加（P=0.011 5）；与mimic-NC组比较，mi RNA-933 mimic组细胞集落显著减少（P=0.001 2）。CCK-8检测结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA组细胞存活率显著增加（P=0.010 3),miRNA-933 mimic组细胞存活率显著下降（P=0.007）（图4）。

图2 miRNA-933对LX-2细胞活化的影响

图3 miRNA-933对LX-2细胞凋亡的影响

图4 miRNA-933对LX-2细胞增殖的影响

2.5 mi RNA-933对KLF6/ATF4/ATF3/CHOP信号轴激活的影响

为进一步明确mi RNA-933调控LX-2细胞生物学功能的相关机制，本研究利用Western Blot技术，检测了敲减与过表达mi RNA-933后，其下游增殖关键蛋白因子KLF6的表达情况。结果如图5a、b所示，敲减mi RNA-933显著抑制KLF6蛋白的表达（P=0.017），而过表达miRNA-933显著促进了KLF6蛋白的表达（P=0.039）。KLF6是肿瘤抑制因子，可以通过ATF4-ATF3-CHOP信号轴促进细胞凋亡的发生。

为验证miRNA-933调控细胞凋亡的具体机制，本研究进一步检测了ATF4/ATF3/CHOP蛋白的表达，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调了ATF4(P=0.039）、ATF3(P=0.007）和CHOP(P=0.012）的表达，而miRNA-933 mimic显著上调了ATF4(P=0.000 5）、ATF3(P=0.000 9）和CHOP(P=0.004）的表达（图5c～e）。

图5 miRNA-933对KLF6/ATF4/ATF3/CHOP信号轴激活的影响

3、讨论

作为一种内源性非编码RNA,miRNA广泛分布于生物体的多种组织器官中，并通过碱基互补配对，在转录水平调控基因的表达[9]。研究[10]发现，miRNA可调控包括细胞增殖、分化、代谢和凋亡在内的多种生物学进程，其表达异常也与多种疾病的发生发展有密切联系，其中包括肝纤维化。肝纤维化是许多慢性肝病不可避免的病理过程，其病理特征是细胞外基质的过量累积[11]，而活化的HSC作为细胞外基质的主要生产来源，在肝纤维化的进展中起着至关重要的作用[12]。

HSC的活化受到众多mi RNA的调控。例如，mi RNA-29家族的mi RNA-29b与mi RNA-29a在休眠期的HSC中表达量极高。mi RNA-29b通过靶向结合在PI3KR1和AKT3的3′-非编码区，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，进而阻止HSC的激活与纤维化的发生[13-14]。而mi RNA-29a通过降低组蛋白脱乙酰酶4的活性，从而抑制HSC的活化[15]。此外另有研究[16]表明，在活化的大鼠HSC中，mi RNA-15b和mi RNA-16的表达明显增加。mi RNA-15b与mi RNA-16靶向Bcl-2，抑制其表达，进而促进HSC凋亡，抑制肝纤维化进程。本研究发现，相较于健康人肝组织，慢性肝病患者肝组织中miRNA-933的表达显著下降。

mi RNA-933的表达不具有组织特异性，在机体的多种组织中均有表达。在口腔鳞状细胞癌的研究[17]中发现，mi RNA-933可影响口腔鳞状细胞的增殖、迁移与凋亡。肺癌的研究[18]中发现，过表达mi RNA-933可抑制A549和H460细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此外，mi RNA-933的单核苷酸多态性位点rs79402775还会提高良性甲状腺瘤的患病风险[19]。本研究也发现，在LX-2细胞中，mi RNA-933过表达能显著抑制LX-2细胞增殖，促进细胞凋亡的发生。

mi RNA-933的靶基因较多。如在乳腺癌的研究[20]中发现，mi RNA-933通过下调Sma同源物2的表达促进了癌细胞的增殖和侵袭。在HBV感染过程中发现，mi RNA-933通过抑制人组蛋白去乙酰化酶11的表达，促进了HBV在细胞中的复制[21]。在2型糖尿病和神经退行性疾病的研究[22]中发现，mi RNA-933可以抑制ATF2，但能上调脑源性神经营养因子，最终影响疾病进展。在肺癌的研究[18]中发现，mi RNA-933可通过促进KLF6的表达，进而影响细胞的增殖、迁移和侵袭，这与本研究的发现相同。KLF6是特异性蛋白1/Kruppel转录因子家族的成员之一，最初是从白细胞克隆而来[23]。研究[24]表明，KLF6是一种肿瘤抑制蛋白，在包括前列腺癌、肾癌在内的多种癌症中下调或突变。在小鼠肝癌模型的研究[25]中发现，KLF6通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶p21 WAF1/Cip1抑制肿瘤生长。KLF6还与细胞周期蛋白D1直接相互作用，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4并导致细胞周期停滞[26]。此外，在非小细胞肺癌和前列腺癌的研究[27-28]中发现，KLF6过表达促进了凋亡的发生。而在肝细胞癌的研究[29]中也发现，KLF6增加了HSC对凋亡应激的敏感性。作为转录调控因子，KLF6能够调控内质网应激通路关键蛋白ATF4的表达，并激活内质网应激通路。ATF4被激活后，会结合ATF3基因的上游ATF/cAMP反应元件，从而级联激活ATF3/CHOP，最终CHOP剪切抑凋亡蛋白Bcl-2，促进细胞凋亡的发生[30]。本研究结果显示，miRNA-933促进了LX-2细胞中KLF6/ATF4/ATF3/CHOP/Bcl-2信号轴的激活，推测是miRNA-933调控LX-2细胞增殖、迁移和凋亡的分子机制。关于miRNA-933如何调控KLF6的表达，其具体分子机制有待进一步阐明。

综上所述，本研究发现，相较于正常肝组织，肝硬化与慢性乙型肝炎肝组织中miRNA-933表达量下降。进一步分析显示，miRNA-933促进了KLF6的表达，抑制了HSC活化与增殖，并通过ATF4/ATF3/CHOP信号通路，促进HSC的凋亡。推测miRNA-933可抑制肝纤维化的进展，为肝纤维化的治疗提供了新的方向。

参考文献:

[18]李海洲,张艳炜,许英杰,等. miR-933调控KLF6基因影响非小细胞肺癌的作用研究[J].中国癌症杂志, 2021, 31(7):581-588. DOI:10.19401/j.cnki.1007-3639.2021.07.004.

基金资助:宁夏医科大学总医院创新项目(2023AAC03584)~~;

文章来源:海龙,马丽娜,雒夏,等.microRNA-933对LX-2细胞凋亡和增殖的影响及其分子机制[J].临床肝胆病杂志,2024,40(07):1382-1389.