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罕见β-珠蛋白基因簇3.5 kb缺失突变的鉴定

2025-02-12 91 上传者：管理员

摘要：目的:明确云南4例疑似β地中海贫血患者的基因突变类型，并对基因型与血液学表型特征进行分析。方法:对4例来自云南地中海贫血流行区傣族、血液学表型与常见地中海贫血基因突变检测结果不符的疑似β地中海贫血样本进行全基因组测序，利用聚合酶链式反应(PCR)和Sanger DNA测序技术对β-珠蛋白基因簇的突变进行确认。结果:4例患者存在3.5 kb的β-珠蛋白基因簇罕见大片段缺失性突变(NC＿000011.10:g.5224302-5227791del3490bp),其中1例检测出合并HbE突变，1例合并CD17突变，这2例突变杂合子患者呈现中度贫血表型，另外2例单纯3.5 kb缺失突变杂合子患者呈现轻度贫血表型。结论:罕见β-珠蛋白基因簇3.5 kb缺失的杂合子携带者可产生轻度贫血，若合并其他β-珠蛋白基因点突变会导致贫血症状加重。在地中海贫血高发区，可疑患者需要进行基因检测以避免漏诊或误诊。

关键词：
β-地中海贫血
基因检测
基因突变
血液学表型特征
遗传疾病
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β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种由β-珠蛋白基因异常引起的单基因常染色体隐性遗传病[1],其主要特征是一个或者多个β-珠蛋白基因突变,导致β-珠蛋白链减少或缺失,有效红细胞生成受阻,最终导致贫血[2]｡在中国南方地区,地中海贫血是最常见且危害严重的单基因遗传病,尤其是两广､海南和云南等地｡在云南,β-地贫的携带率为2.7%[3],且在傣族､阿昌族等少数民族中尤为高发,在傣族中的携带率高达29%[4]｡β-地贫的发病机制大多源于β-珠蛋白基因发生点突变,只有少部分是由于基因缺失所致[5]｡尽管现有的地中海贫血突变基因检测可涵盖90%以上的常见β-地贫突变类型,但仍有少部分的罕见大片段缺失无法被常规方法检测出来[6]｡在中国人群中,已报道的大片段β-珠蛋白基因簇缺失型地贫至少有5种类型,包括中国型(NC_000011.9:g.5191148-5270051del)､云南型(NC_000011.9:g.5204076_5271203del)､广州型(NC_000011.9:g.(5240000-52466965271087del)､东南亚型-HPFH缺失(NC_000011.9:g.5222878_5250288del)和台湾型(NG_000007.3:g.69997_71353del)[7]｡由于常见的地贫筛查方法和试剂盒在发现这些罕见缺失突变方面具有局限性,常常会影响地贫诊断,临床上易导致误诊和漏诊｡随着高通量测序技术的发展与应用,越来越多的β-珠蛋白基因簇缺失病例被不断发现,为解释和纠正β-地贫患者基因型与表型结果不符的现象提供了有力支持｡但是由于报道例数较少,临床上针对这些罕见缺失型地贫突变的血液学表型和基因型的特征仍然缺乏认知｡本研究通过高通量测序技术,对来自云南省德宏地区的4例贫血患者的基因型与血液学表型进行分析,发现并报道β-珠蛋白基因簇3.5kb罕见大片段缺失型突变,从而为β-缺失型地贫的鉴别和诊断提供更多的参考依据｡

一、对象和方法

研究对象

4例患者(编号A､B､C､D)来自云南省德宏傣族景颇族自治州,均为女性､傣族,年龄分别为28(A)､8(B)､18(C)和4(D)岁｡患者A和患者B为母女关系,3个家庭之间无亲缘关系,门诊血液学检测结果均显示疑似β-地中海贫血｡本研究已获得患者知情同意,并通过德宏州人民医院伦理委员会伦理审查(DYLL-KY2020005)｡

外周血全基因组DNA提取

采集4例患者EDTA-K2抗凝外周静脉血2-3mL｡使用UEBloodGenomicDNAMiniprepKit(江苏优逸兰迪生物科技有限公司),严格按照说明书操作,提取基因组DNA｡

血液学检查

利用血细胞自动分析仪对患者外周血进行血常规分析,收集红细胞计数(RBC)､血红蛋白(Hb)､平均红细胞体积(MCV)､平均红细胞血红蛋白(MCH)､细胞血红蛋白浓度(MCHC)等数据｡同时,对患者血红蛋白HbA､HbA2､HbF等各项参数进行检测并收集数据｡

基因型检测

采用基于PCR-反向点杂交技术的地中海贫血(α/β)基因检测试剂盒(达安基因,广州)检测常见中国人α-/β-地中海贫血基因型,包括α-珠蛋白基因3种缺失(--SEA､-α3.7和-α4.2)､3种突变(WS122､QS125和CS142),以及β-珠蛋白基因17种常见突变(CD41-42､IVS-2-654､CD17､-28､CD26､CD71-72､CD43､-29､Int､CD14-15､CD27-28､-32､-30､IVS1-1､IVS-1-5､CD31和Cap)｡患者的血液DNA样品送至北京贝瑞和康生物技术有限公司,基于三代测序平台PacBioSequelⅡ,应用SMRT测序技术进行全基因组测序｡

Sanger测序验证基因缺失

针对三代测序结果显示存在β-珠蛋白基因3.5kb缺失的患者,进一步采用聚合酶链式反应(PCR)扩增特定区域,扩增产物进行SangerDNA测序,测序引物设计参照文献[7],正向引物:5’-TGTCCCCAGTTAACCTCCTATT-3’,反向引物:5’-ATAGATTGGGAAGGGGAAAATG-3’(参考基因组GRCh38/hg38)｡PCR扩增反应使用Bio-Rad公司的PCR扩增仪进行,反应体系如下:2×PhantaMaxMasterMix(Vazyme公司)25μl,基因组DNA3μl,上下游引物各2μl,ddH2O补足50μl｡反应程序:95℃预变性3min;95℃变性15sec,55℃退火15sec,72℃延伸45sec,循环35次后;最后72℃延伸5min｡PCR扩增产物由生物工程(上海)股份有限公司分别采用正向和反向引物进行双向测序,利用Snapgene软件对测序结果进行序列比对及分析｡

二、结果

血液学检测结果

4例受检患者均出现Hb含量的降低,显示有轻度贫血(患者B､C)和中度贫血(患者A､D),MCV和MCH降低,表现出小细胞低色素性贫血特征｡血红蛋白电泳检测显示,4例患者HbA2的水平均有上升,且HbA2>3.5%,提示为β-地中海贫血,患者A检出HbE条带(表1)｡

基因突变检测结果

针对4例患者,对常见的23个地中海贫血基因突变进行检测,结果显示,患者A为HbE(HBB:c.79G>A)突变纯合子,这一突变导致β珠蛋白基因的第26位密码子发生错义突变,由谷氨酸(Glu)错义突变为赖氨酸(Lys),可导致β珠蛋白链合成轻度减少,属于β+地贫基因｡患者D为CD17(HBB:c.52A>T)突变纯合子,该突变严重影响β珠蛋白链完全不能合成,为β0地贫基因｡患者B和C中未检出常见突变｡

三代测序技术检测结果显示,4例患者均存在β-珠蛋白基因簇3.5kb(NC_000011.10:g.5224302-5227791del3490bp)的缺失突变｡通过靶向缺失区域的引物进行PCR扩增,可见杂合子患者存在3490bp的基因片段缺失(图1),进一步证实存在基因片段缺失｡将含缺失位点的扩增片段(图1中1333bp片段)经Sanger测序,通过与人类参考基因组hg38数据库序列进行比对分析,结果显示,该β-珠蛋白基因簇缺失片段的5’断裂点位于第5224302位,3’断裂点位于第5227791位(图2),与三代测序结果完全一致,证实缺失片段的大小为3490bp(按之前的报道称为3.5kb缺失突变)｡PCR扩增检测缺失突变的代表性琼脂糖凝胶电泳结果见图1,Sanger测序代表性结果见图2

三、讨论

本研究通过三代测序技术发现4例携带有3.5kb缺失的患者,并通过SangerDNA测序进行进一步的确认｡与人类参考基因组hg38数据库的比对分析发现3.5kb缺失的5’的断裂点位于5224302位,3’的断裂点位于5227791位,缺失基因片段(NC_000011.10:g.5224302-5227791del3490bp)与Lynch等[8]先前的描述一致,片段缺失删除了β-珠蛋白基因的启动子和整个β-珠蛋白基因｡β-珠蛋白基因簇3.5kb缺失在早先报道的泰国南部被认为是较常见的一种遗传突变[9],其患病率在0.3%4.3%[10]｡该突变首例报道于泰国北部,为一名8岁女性患者[11],同时携带有CD17无义突变,HbA2的百分比为1.9%,HbF的百分比为8.5%,表现为严重贫血,需要接受大量输血治疗维持生命｡之后陆续有学者对该突变进行了报道[8,12-13],但目前在国内仅报道过广西地区一例4岁壮族女孩患者具有3.5Kb缺失合并IVS-II-654突变的病例,HbA2的百分比为1.9%,HbF的百分比为98.1%,自2岁起,每3-4周输血一次,该患者表现为严重输血依赖性贫血[7]｡因此,对于该罕见缺失突变的研究报道十分重要｡目前,国内仍然缺少该突变在人群中的分布和临床表型信息,本研究是该缺失突变在国内的第二个报道,4名患者均为傣族,证实了该突变在中国不同地区和人群中的存在,为临床诊疗提供了更多参考依据｡

从临床表型上看,β-珠蛋白基因簇3.5kb缺失突变属于β0突变｡本研究中2例单纯杂合子(病例B,C)表现为轻度的地中海贫血症状,这与此前文献[7]中描述的先证者的母亲情况一致｡本研究中患者来源地区为云南省西南边境地区,属于地中海贫血高发地区,当3.5kb缺失突变合并有其它α或β珠蛋白基因突变时,可呈现出表型差异｡2例患者(病例A,D)分别为3.5kb缺失突变与HbE(β0/βE)或与CD17(β0/β0)突变形成复合突变杂合子,均表现出中度贫血的临床表型｡特别是β0/β0突变,常常导致中重度贫血｡本研究结果表明,在地贫流行区加强对罕见缺失突变的检测尤为重要｡针对可疑的3.5kb缺失突变推荐用PCR的方法进行筛查,或采用高通量测序等方法｡

在地贫诊断时,目前最常用的反向点杂交地贫检测试剂盒存在局限性,不能检出3.5kb缺失突变,以致于3.5kb缺失突变与其它β珠蛋白基因突变形成复合突变杂合子时,其他β基因突变杂合子的检测可呈现出突变纯合子样的结果,从而难以解释基因型与血液学表型｡例如,患者D为3.5kb/CD17复合突变杂合子,在常规反向点杂交检测中该患者被误判为CD17突变纯合子,产生基因型诊断错误和遗传咨询困难｡此外,对于3.5kb缺失突变的杂合子(病例B和C),常规检测方法则不能识别该突变,易产生漏诊,并难以解释患者的轻度贫血和血红蛋白电泳结果｡结合本研究和国内外文献[7,11],携带该缺失突变可引起轻度贫血,如合并其他β基因突变可导致贫血症状加重,尤其是在地贫流行区可能导致基因型为β0/β0的重型β-地贫患儿,表现为中重度贫血,因此,孕前和产前筛查中应对此引起重视｡本研究中2例相同基因型的3.5kb缺失突变携带者(病例B和C)存在临床表型多样性现象,HbF水平分别为1.9%和16.3%,差异显著,提示,除基因突变外,还可能存在其他表型修饰因素｡

本研究发现β-珠蛋白基因簇中一种罕见的3.5kb大片段缺失,该3.5kb缺失常导致HbF水平升高｡相较于其他类型的缺失型地贫,如中国型Gγ+(Aγδβ)0缺失､台湾型缺失､东南亚型-HPFH缺失的患者的HbF水平均有显著升高[6]｡针对β-珠蛋白基因簇大片段缺失患者常表现的HbF水平升高的具体机制还不完全清楚｡有研究发现,大多β-地贫点突变杂合子成人通常表现为HbF正常(01%),而在β-地贫3.5kb缺失突变杂合子患者中多能观察到HbF(1%-10%)的水平都较高,且在不同患者间HbF水平差异较大,复合突变患者的HbF水平明显较高,提示,中重度贫血刺激骨髓造血细胞增生[12]｡也有研究认为,HbF水平的升高可能是由于β-珠蛋白基因启动子的缺失减少对限制性转录因子的竞争,进而上调γ-和δ-珠蛋白基因启动子的活性,促使基因转录有关[14]｡

本研究鉴定了云南地区4例β-珠蛋白基因3.5kb罕见大片段缺失的病例,进一步丰富了中国不同人群和地区地中海贫血基因突变谱和表型数据,为疑难地中海贫血病例的筛查､诊疗和遗传咨询提供了更多的参考信息｡本研究在傣族病例中发现了罕见的地中海贫血缺失突变以及相关临床表型的异质性｡作为跨境民族,中国云南的傣族和泰国等南亚东南亚的族群具有相关的民族源流,进一步追溯该突变的源流,以及探讨其表型相关的遗传修饰因子,将有助于更深入了解地中海贫血基因突变的分子病理机制｡

参考文献:

3商璇,徐湘民.地中海贫血的分子基础与精准诊断.中国实用儿科杂志,2018,33(12):954-957.

4丁雪梅,曾小红,朱宝生,等.5450例云南省育龄人群地中海贫血筛查结果分析.临床检验杂志,2014,32(9):693-696.

5徐湘民.地中海贫血预防控制操作指南.北京:人民军医出版社,2011:20

6王继成,姚翠泽,黄演林,等.中国人3种最常见缺失型β地中海贫血的鉴别诊断.中国实验血液学杂志,2021,29(4):1247-1250.

基金资助:云南省基础研究计划(202101AY070001-230);云南省医学领军人才培养计划(L-2018003);

文章来源:番云华,段翠琳,罗赛丽,等.罕见β-珠蛋白基因簇3.5 kb缺失突变的鉴定[J].中国实验血液学杂志,2025,33(01):175-179.