心房颤动是临床上最常见的房性心律失常,心力衰竭和脑卒中是其死亡的主要原因,AF卒中发生率比非AF患者高5～7倍,成为严重威胁人类健康的疾病之一[1]。目前导管射频消融已成为症状性AF患者的一线治疗,在阵发性AF患者中取得较好的效果,单次手术10年成功率可达到58%,多次手术可明显降低复发率[2]。然而对于持续性AF患者,其疗效仍较差[3]。抗心律失常药物因转复律低,目前临床应用仍然受限,同时因缺乏特异性,易导致全身毒副作用和诱发恶性心律失常[4]。但是导致持续性AF治疗效果差的根本原因是与其发病机制不明有关。因此,探讨AF发生机制对于提高AF的诊疗至关重要。

心房重构是AF发生、发展的主要病理生理学机制,也是AF触发和维持的病理基质[5]。其中以心房成纤维细胞异常增殖、心肌细胞凋亡和间质纤维化为特征的心房重构是持续性AF的主要特征[6]。同时心房纤维化严重程度和AF的病程及预后密切相关,并且改善心房纤维化可以改善AF的预后,降低AF导管射频消融后的复发率[7]。虽然目前有研究报道心脏在各种不利因素刺激下引起基因及信号通路的异常表达导致成纤维细胞增殖和间质纤维化是导致AF心房重构的主要因素,但确切发病机制尚未阐明。因此,深入探讨AF心房重构的分子机制,有助于提高AF的诊疗。

在人类基因组中,约有93%的DNA序列可以被转录为RNA,但仅有不到2%的核酸序列被用于编码蛋白质,其余的转录产物均为不编码蛋白质的非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)[8]。在众多类型ncRNA中,长度为19～24nt的miRNA是一类进化上高度保守的非编码小分子单链,通过与靶mRNA的3'UTR完全或不完全互补配对在转录后水平降解mRNA或抑制蛋白翻译,在心血管生理和病理过程中发挥着重要作用[9]。已经有研究证实miRNA通过调控心房纤维化引起心房重构促进AF发生[10],同时也可影响心房离子通道蛋白表达参与心房电重构[11],更为重要的是,miRNA还可作为AF诊断及预后的分子标志物[12]。然而,miRNA在AF中的分子机制依然有待进一步探讨,特别是关于miRNA如何通过调控AF结构重构参与AF的发生发展仍有待进一步阐述。本研究首先检测AF患者心房组织和外周血中miR-199-3p表达差异,其次通过ROC曲线分析miR-199-3p对AF的诊断价值。最后探讨miR-199-3p对AF心房重构过程中成纤维细胞增殖和纤维化的作用及可能的分子机制,为AF诊断及拮抗AF心房病理性重构寻找新的分子靶点。

1、对象与方法

1.1对象

入选标准:本研究包括2个队列人群,第一队列为连续入选2018年11月-2019年11月在云南省第一人民医院心内科住院的AF患者,其中持续性AF50例,阵发性AF50例。以基线资料相匹配的非AF患者50例作为对照。有40例持续性AF患者接受导管射频消融治疗。第二队列人群为在我院心脏大血管外科接受手术的AF患者6例和窦性心律(SR)患者4例。

排除标准:①年龄<18岁或>80岁;②严重的潜在心血管疾病;③左房或左心耳血栓;④怀孕;⑤有口服抗凝药物禁忌证;⑥肝肾功能不全;⑦左房舒张末内径>50mm;⑧左室射血分数(LVEF)<40%,或NYHAⅡ级以上;⑨合并其他全身疾病。本研究方案经云南省第一人民医院伦理委员会批准,所有参与研究的患者均提供书面知情同意书,所有实验程序都符合《赫尔辛基宣言》。

1.2血浆和心组织收集

采用EDTA-K2试管收集10ml血浆,并在采集后1h内进行处理,按照试剂盒操作说明书提取血浆中的RNA,然后储存在-80℃直到进一步处理。心房组织在打开右房后取适量右心耳组织,去除血和脂肪组织,立即保存于液氮中。

1.3qRT-PCR

qRT-PCR在ABI7900实时PCR仪上进行,PCR反应体系包括1μlcDNA、1μl的引物、5μlSYBR和3μlDEPC水,反应条件:95℃1min,95℃15s,60℃60s,95℃15s,60℃15s,95℃15min,第2～4步35～40个循环,miRNA相对表达以hsa-miR-16作为内参,mRNA相对表达以GAPDH为内参,利用2-△△Ct方法计算RNA相对表达量。

1.4左房电压基质标测

所有入选患者完善术前准备后,术中采用局麻和芬太尼镇静,常规穿刺右侧股静脉2次,通过引导钢丝置入2根SL1长鞘(Swartz,SL1,8.5F,StJudeMedical,Minnesota,USA),成功穿刺房间隔后,置入消融导管常规行双侧肺静脉电隔离,在肺静脉隔离成功后如果患者心律转为SR,则开始左房电压基质标测,如果患者心律仍为AF节律,则在电复律转为窦律后开始左房电压基质标测。在三维标测系统下采用Pentary标测导管在SR下进行左房电压基质标测,每个患者共取300～1000个点。将标测电压范围设定为0.1～0.4mV,将低于0.4mV的局部电图定义为低电压区,反映左房纤维化的程度。左房纤维化程度以左房表面低电压区面积除以左房总表面积计算。

1.5小鼠成纤维细胞的分离

采用Percoll分层液(Sigma公司)差速离心分离成纤维细胞[13]。常规麻醉小鼠后取出心脏,去除心脏脂肪组织和血凝块,将心脏剪碎成1mm3后用PBS清洗转移至安培瓶中,之后,组织样本用DMEM培养基中包括0.1%胶原酶Ⅱ和胰酶消化10min后,离心后去除上清液后再次消化和离心,最后将所获得的细胞用DMEM悬浮。细胞纯化参照percoll分层液说明书,按照说明书配制不同密度percoll分层液,把细胞悬液加入分层液最上层,3000r/min,离心30min后可见细胞分3层,最上层是成纤维细胞,中间层是心肌细胞,最下层是血细胞及上皮细胞等,吸取成纤维细胞进行后续细胞培养和实验。

1.6细胞计数盒-8实验

采用细胞计数盒-8(CCK8)检测成纤维细胞增殖情况,将成纤维细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板,转染miR-199-3p,转染48h后,10μl的CCK-8溶液加入到90μl培养液中,在37℃、5%CO2培养箱继续孵育2h,在450nm波长酶标分析仪记录光学密度(OD)值。

1.7Westernblot

按照我们前期描述方法提取蛋白和Westernblot[13],采用cocktail蛋白裂解液(蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF)提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度。取相同量总蛋白行SDS-PAGE电泳,80V电压20～30min,120V电压约90min。300mA湿转印120min,将蛋白转印到PVDF膜,用5%脱脂奶粉室温封闭1h,根据需要加入一抗,4℃孵育过夜,次日根据一抗加入相应的二抗,ECL发光液在ChemiDocTMXRS+System(Bio-RAD)显影,用Image软件曝光加灰度值分析。

1.8双荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测方法在我们前期发表的文章中有详细的描述[14]。将包含3'UTRs在内的SP1DNA片段插入到EcoRIandXhoI位置,构建pcDNA3.0-SP1载体。将包含靶点位置的1.0μg的荧光素酶报告载体,100nMmiR-199-3pmimics,miR-NC,0.06μgRenilla荧光素酶对照载体共同转染至HEK293细胞中,48h后收集细胞,通过双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶的活性;计算相对荧光素酶活性值。使用QuickChangeXL位点直接突变试剂盒对人SP1的miR-199-3p结合位点的3'UTRs进行基因突变。

1.9统计学处理

连续变量以x¯±s表示,2组之间的比较用非配对t检验或非参数U检验。分类变量用例数和%表示,组间比较采用χ2检验。通过受试者工作特征(ROC)曲线确定miR-199-3p对AF的诊断价值及相应的敏感性和特异性。采用Pearson相关系数分析miR-199-3p和左房纤维化的相关性,对相对纤维化面积值进行对数变换,使其呈正态分布。采用SPSS16.0和Graphpad7.0软件分析和作图,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1基线资料特征

本研究包括2个队列人群,基线人口统计学特征如表1、2所示。2组人群的基线特征分布相似。

表1队列1患者的基线资料特征

2.2miR-199-3p在AF患者中的表达变化

qRT-PCR结果显示AF组患者外周血中miR-199-3p表达低于对照组[(0.38±0.31)∶(1.25±0.89),P<0.01],见表1;且在持续性AF患者外周血中表达低于阵发性AF[(0.42±0.20)∶(1.08±0.48),P<0.01]。进一步检测AF患者心房组织中miR-199-3p表达水平,结果显示AF患者心房组织中miR-199-3p表达水平低于SR患者[(0.48±0.03)∶(1.00±0.12),P<0.01)],见表2。

表2队列2患者的基线资料特征

2.3miR-199-3p对AF的诊断价值及与左房纤维化的关系

利用ROC曲线分析miR-199-3p差异表达对AF的诊断价值,AF患者中miR-199-3p的ROC曲线下面积(AUC)为0.90(95%CI:0.85～0.94,P<0.01),其敏感性为81%,特异性为86%(图1a)。进一步分析外周血中下降miR-199-3p表达能否鉴别持续性AF,结果显示AUC为0.91(95%CI:0.86～0.97,P<0.01),其敏感性为98%,特异性为73%(图1b)。在通过对40例持续性AF在导管射频消融术中行左房电压基质标测左房低电压区域范围,以反映左房纤维化程度,Pearson相关系数分析显示miR-199-3p表达水平和左房纤维化程度呈负相关(r=-0.863,P<0.01)(图1c)。

图1ROC曲线分析miR-199-3p对AF的诊断价值及其与左房纤维化的关系

2.4miR-199-3p对成纤维细胞增殖的影响

CCK-8结果显示下调miR-199-3p表达可促进心房成纤维细胞增殖,而过表达miR-199-3p表达可抑制成纤维细胞增殖。进一步检测增殖和纤维化标志物,结果显示沉默miR-199-3p可促进Ki-67、CyclinD1、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达,而过表达miR-199-3p则抑制Ki-67、CyclinD1、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达(图2)。

图2miR-199-3p对成纤维细胞增殖及纤维化的影响

2.5SP1是miR-199-3p直接靶基因

首先通过Targetscan7.2等网站预测发现SP1的3'UTRs存在miR-199-3p的结合位点,进一步利用荧光素酶报告基因实验证实miR-199-3p与SP1的3'UTRs可直接结合。同时在成纤维细胞中沉默miR-199-3p可促进SP1的蛋白表达,最后检测AF心房组织SP1的表达,结果显示AF患者心房组织中SP1的表达高于SR患者(图3)。

图3miR-199-3p直接靶向调控SP1表达

3、讨论

本研究首次发现miR-199-3p在AF患者心房组织和外周血中表达都下降,且miR-199-3p在持续性AF中的表达水平低于阵发性AF。其次,ROC曲线分析发现外周血中miR-199-3p表达下降不仅可鉴别AF,还可从阵发性AF患者中鉴别出持续性AF,且Pearson相关系数分析显示miR-199-3p表达水平和左房纤维化程度呈负相关。最后功能研究显示miR-199-3p可通过靶向调控SP1负性调控成纤维细胞增殖和纤维化。因此,外周血中的miR-199-3p可作为AF的非侵入性诊断生物标志物和纤维化预测标志物。

目前,AF的诊断主要依赖于12导联心电图或动态心电图记录到绝对不规则的R-R间期、规则的P波消失代之以不规则的AF小f波[15]。然而,相当比例的AF为无症状性AF,多数因心力衰竭、卒中、心肌梗死等并发症就诊后确诊为AF,因此失去了早期治疗的机会,严重增加患者病死率和社会经济负担[16]。因此,我们迫切需要寻找敏感性和特异性高的早期无创诊断标志物,通过早期识别无症状性AF,可提高AF治疗效果和减少并发症。越来越多的证据表明,miRNAs作为心血管疾病的关键调控因子,以及循环miRNAs因其在病理条件下携带疾病特异性信息,且易于获得,可作为心血管疾病的非侵入性诊断生物标志物[17]。同时,miRNAs的表达水平在AF的不同阶段呈现动态变化,可以作为疾病诊断、预测和预后的生物标志物[18]。因此,本研究中我们首先在AF患者的血浆和心房组织中筛选差异表达的miRNA,发现miR-199-3p在AF患者心房组织和血浆中表达都下调,更为重要的是,持续性AF患者血浆中miR-199-3p表达水平低于阵发性AF。最后通过ROC曲线分析发现血浆中下降的miR-199-3p不仅可从正常患者中识别出AF患者,更可从阵发性AF患者中识别出持续性AF。上述研究结果提示miR-199-3p可能参与AF发生发展,并且和AF的病程相关,使得miR-199-3p有望成为AF早期诊断的潜在生物学标志物。

心房纤维化是房性心律失常结构重构的重要标志,也是AF发生发展的重要病理基质[5]。并且心房纤维化的严重程度与AF类型及预后呈正相关[19]。既往研究显示持续性AF的左房基质较阵发性AF差,这也是导致导管射频消融在持续性AF患者中效果较差的原因之一[7]。因此,寻找能够识别早期AF的生物标志物对早期干预和改善预后至关重要,特别是持续性AF左房纤维化的标志物,可以指导选择合适导管射频消融的持续性AF患者,有助于提高射频消融成功率。同时可以通过检测miR-199-3p表达发现低表达miR-199-3p的患者,为早期启动抗心律失常药物治疗提供个体化的治疗。更为重要的是,本研究还发现miR-199-3p表达和左房纤维化呈负相关,提示miR-199-3p可能成为未来早期诊断心房纤维化的一个敏感的生物标志物。

越来越多的证据表明心房重构在AF的发病过程中起着关键作用[20]。心房电重构主要表现为动作电位和有效不应期缩短[21],而结构重构主要表现为心房成纤维细胞异常增殖,细胞凋亡和间质纤维化[22]。目前临床可通过抗心律失常药物和导管射频消融来改善心房电重构[23],然而,包括血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)或他汀类等药物在缓解或逆转结构重构的作用有限[24,25]。因此,探讨心房重构的分子机制具有重要意义,越来越多的证据表明,人类miRNAs是AF心房重构的关键调控因子,而成纤维细胞增殖和纤维化是AF心房重构的重要标志。因此本研究探讨miR-199-3p对成纤维细胞增殖和纤维化的影响,结果显示miR-199a-3p可负性调控成纤维细胞增殖和纤维化。表明心房组织和血浆不适当下调miR-199-3p可通过促进心房成纤维细胞增殖和纤维化导致心房重构进而促进AF的发生和发展。

更为重要的是,本研究通过荧光素酶报告基因实验证实SP1是miR-199-3p的直接靶基因。早期研究显示SP1可直接调节心脏基因的表达参与调控心肌病理性肥大过程[26],SP1还参与AngⅡ诱导的心肌纤维化过程[27]。更为重要的是,SP1还可直接促进TGF-β1转录表达,TGF-β1通过心房成纤维细胞增殖和细胞外基质合成促进心房重构[10]。同时SP1还作为多个信号通路的靶蛋白参与细胞凋亡、炎症反应和纤维化过程,如LncRNA-PVT1通过miR-128-3p/SP1信号轴促进TGF-β1-Smad表达调控AF心房纤维化[28]。上述既往研究提示SP1可能是参与心脏重构的重要分子,而本研究显示miR-199-3p可通过靶向SP1调控成纤维细胞增殖和纤维化导致心房重构,进一步拓展了AF发生的分子机制。

综上所述,本研究发现miR-199-3p在AF患者心房组织和外周血中表达下降,且外周血中miR-199-3p表达和左房纤维化呈负相关。此外,miR-199-3p可通过靶向调控SP1负性调控成纤维细胞增殖和纤维化参与AF心房重构。因此,miR-199-3p有望成为临床AF潜在的非侵入性诊断标志物和纤维化的预测标志物。

参考文献：

[13]魏飞宇,吕丽,张进,等,Popdc2在心脏肥大中的表达及其对病理性心肌肥大的影响[J].临床心血管病杂志,2018,34(3):311-316.

魏飞宇,范洁,高田,王礼琳.miR-199-3p通过靶向调控SP1促进成纤维细胞增殖对心房颤动心房重构的影响[J].临床心血管病杂志,2020,36(06):523-530.

基金:云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项面上项目(No:2019FE001(-291)).