近年来DM发病率以及死亡率逐年递增,而诱发死亡的主要原因是心血管疾病。Wnt/β-catenin信号通路在细胞增殖、迁移、分化等调控过程中均有参与。最新报道指出,在主动脉内皮细胞生长及分化过程中Wnt/β-catenin信号通路也有参与,对心血管疾病及细胞代谢综合征发病率有重要影响[1,2,3]。晚期糖基化终末产物受体(receptorforadvancedglycationendproduct,RAGE)与配体结合可激活多条信号通路如ERK1/2(p44/p42)、PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin、SAPK/JNK等,启动下游NF-κB等核转录因子活性,调节机体免疫系统[4,5]。虽然Wnt/β-catenin信号通路已被报道参与动脉血管内皮细胞保护过程[6,7],但对DM主动脉的具体保护机制尚未明确。文章旨在检测2型糖尿病(type2diabetes,D2M)大鼠主动脉中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平以及RAGE的表达变化,探究RAGE对DM大鼠主动脉中该信号通路相关蛋白表达的调节作用以及对主动脉的保护机制,为今后临床治疗DM主动脉病变提供一些信息。

1、材料与方法

1.1 模型的制备

随取50只3月龄健康雄性SD大鼠,清洁级,体质量约150～180g,由四川大学动物研究中心提供。常规饲养大鼠,7d后根据体质量均衡原则随机分组,分为对照组(A组)10只,DM模型组(B组)40只。A组常规饲料喂养,自由饮水。B组大鼠模型制备步骤为(1)高脂模型的构建:在常规饲料中添加30%猪油、2.5%胆固醇以及1%脱氧胆酸钠制备高脂流质饲料,灌胃大鼠,自由饮水,持续饲喂5w;后空腹采集大鼠颈静脉窦处血液,检测血清总胆固醇(serumtotalcholesterol,TC)、甘油三酯(trigly-ceride,TG)等指标,确定大鼠高脂模型构建成功;(2)DM模型的构建:于4℃条件下用pH值4.5、30mg/kg柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液制备浓度为1%的链脲佐菌素(streptozocin,STZ),一次性腹腔注射大鼠,使其呈现胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)状态;3d后空腹状态下尾静脉取血,测定空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG),DM大鼠模型构建成功标准为FBG>11.1mmol/L。

将B组建模成功的36只DM大鼠随机分为2、4、8和12w模型组,每组9只,再次高脂饲料灌胃。其余4只造模失败的大鼠颈椎脱臼处死。A组大鼠按普通饲料继续喂养,两组饲喂均持续4w。

1.2 材料与试剂

STZ及戊巴比妥钠,购自Sigma-Aldrich公司;TG、TC以及高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoprotein-cholesterol,LDL-C)、胰岛素检测试剂盒,购自上海一研生物科技有限公司;山羊抗兔/小鼠IgG-Biotin二抗试剂盒、Westernblotting检测用一抗去除液、细胞裂解液、二抗去除液、转膜液,购自上海闪晶分子生物科技有限公司;SDS-PAGE凝胶及电泳液、BCA蛋白试剂盒、0.45μmPVDF膜,购自北京索莱宝科技有限公司;抗Wnt2、β-catenin、TCF4、β-actin等单克隆抗体及PCR试剂盒,购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 FBG及胰岛素水平的测定

B组持续5w的高脂饲料灌胃后,于腹腔一次性注射STZ,处理3d后禁食12h。采集大鼠颈静脉窦血液样本,3000×g离心10min。取上清,测定FBG及空腹胰岛素(fastinginsulin,FINS)水平。根据以下公式计算胰岛素敏感指数(insulinsensitiveindex,ISI),分析胰岛素敏感性变化情况,公式如下:

ISI=ln[1/(FINS×FBG)]

1.4 样本的获取

建模成功后,按实验设计于第2、4、8以及12周采集大鼠腹主动脉血液,5mL/只,3000×g离心10min,取部分上清液,于-20℃保存备用。迅速取出大鼠主动脉,用预冷的生理盐水冲洗,滤干,剔除血管周围脂肪组织。将组织样本均分成2份,一部分用4%多聚甲醛固定,脱水、透明、包埋等处理后制成主动脉组织石蜡块;另一部分放入EP管中,液氮保存。

1.5 HE染色

将1.4制得的石蜡切片以常规操作脱蜡至水,进行HE染色。将切片置于EclipseTE2000-S免疫荧光显微镜下摄片观察。

1.6 Westernblotting检测

按1.4步骤取各组大鼠主动脉组织,制成匀浆,将1mmol/LPMSF裂解液按100～200μL/20mg比例添加至组织匀浆中,于4℃条件下以14000×g离心10min。取部分匀浆上清液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。在8%凝胶中上样20～50μg总蛋白进行电泳、分离。冰浴后上样凝胶,300mA恒流电湿法转膜,持续2h。用5%脱脂奶粉封闭,1h后加入相应一抗,4℃孵育过夜。在TBST洗液中漂洗样本,加入Biotin标记的二抗,孵育15min显色,灰度分析软件定量分析。

1.7 RT-PCR检测

每组大鼠各取主动脉组织100～150mg,制成匀浆,严格按照说明书提取组织总RNA。反转录时严格按照AMV反转录试剂盒说明书操作,于4℃保存。94℃预变性3min,相同条件下变性反应30s,后于55℃变性30s;72℃延伸60s,重复35个循环;72℃延伸5min,快速冷却,于4℃条件下保存备用。使用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳,于凝胶成像仪观察。采用BandScan5.0软件检测生成条带的灰度值,观察各项灰度值的比值,对数据进行统计分析。

1.8 统计学处理

用SPSS19.0统计软件分析数据,以x¯±sx¯±s表示,采用方差分析、t检验比较组间差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 大鼠D2M模型的构建

研究过程中,A组大鼠状态良好、毛色正常,自主活动正常,对外界刺激具有明显反应,未出现死亡情况。B组大鼠状态较差,体形消瘦,精神不济,毛色晦暗且体味腥臭浓重。随着造模时间延长,该组大鼠的多饮、多食、多尿及上述情况不断加重,生存状态不断变差,成功建模大鼠共计36只,成功率90%。

2.2 造模后大鼠体质量变化及FBG、FINS、ISI水平检测

注射STZ造模3d后,A组大鼠体质量均增加,FBG、FINS水平相较B组显著下降(P<0.01,P<0.05),而ISI水平显著增加(P<0.01),说明D2M大鼠模型构建成功(表1)。

表1大鼠建模成功指标比较

2.3 大鼠血生化指标的检测

比较模型组与空白对照组大鼠血清FBG、TG、TC和LDL-C水平,模型组显著高于对照组(P<0.01,P<0.05)。经比较,上述生化指标中TG在第4、8周时的水平略高于第2周,而HDL-C水平出现小幅度下降(P<0.05)。(表2)

表2D2M大鼠血生化指标的变化(mmol/L)

2.4 大鼠主动脉内皮组织的病理观察

观察大鼠主动脉内皮细胞结构变化,发现A组大鼠组织情况良好,并未出现病理性改变(图1A);而B组大鼠部分主动脉内皮细胞的细胞核出现不同程度改变,排列紊乱,而后几个时间点的部分D2M大鼠内皮细胞局部出现变性、空泡化现象,严重的细胞发生坏死(图1B)。

图1两组大鼠主动脉内皮组织HE染色(×400)

2.5 Wnt/β-catenin信号通路及RAGE相关蛋白在大鼠主动脉组织中的表达

Westernblotting比较Wnt2、β-catenin在D2M组、空白对照组大鼠主动脉组织中的表达。结果显示,D2M组大鼠在2w及4w上述指标表达量显著升高(P<0.05,P<0.01)。第2至12周,D2M组大鼠血清中TCF4、RAGE蛋白表达量较空白对照组持续升高(P<0.05)。(图2、表3)

图2Westernblotting检测两组大鼠主动脉组织总蛋白中Wnt2、

β-catenin、TCF4和RAGE的表达量

表3大鼠主动脉组织总蛋白中Wnt2、β-catenin、TCF4和RAGE的表达量(mmol/L)下载原表

2.6 Wnt/β-catenin信号通路及RAGEmRNA在大鼠主动脉组织中的水平

Wnt2、β-catenin、TCF4、RAGEmRNA在空白对照组大鼠主动脉组织中均有一定程度的表达,而各D2M组大鼠较空白对照组Wnt2、β-cateninmRNA表达量显著升高(P<0.01);RAGE、TCF4mRNA表达持续增加,而sFRP2mRNA表达量持续降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);Wnt2、β-catenin、TCF4、sFRP2、RAGEmRNA表达量在第4、8、12周较第2周差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(表4,图3)

表4Wnt/β-catenin信号通路、TCF4、RAGE和sFRP2的mRNA表达量(mmol/L)

图3Wnt/β-catenin信号通路、TCF4、RAGE和sFRP2的mRNA表达量统计

3、讨论

DM是导致机体多脏器受损的主要疾病之一,D2M致死、致残的主要诱因为主动脉等大血管病变[8,9,10,11]。现有文献中针对DM主动脉内皮细胞病变的具体发病机制以及相关信号通路研究得较少,故明确引发血管内皮功能异常的具体机制有助于治疗血管内皮功能障碍,可能成为防治D2M心血管并发症的新靶点[12,13,14]。此外,糖尿病主要临床特征为血糖异常、血脂代谢紊乱等,如果患者没有得到及时治疗会演化为心血管病变,不利于预后,值得观察研究。

本研究采用高脂饲料喂养并联合STZ构建大鼠D2M模型,发现模型组较空白对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高,并且血糖维持在较高水平伴IR,呈现D2M状态。本研究中,D2M大鼠的FBG水平显著上升,而体质量远低于空白对照组,部分D2M大鼠主动脉组织伴有局灶性内皮细胞空泡变性现象,严重者出现坏死,证明D2M在不同程度上造成机体大血管损伤。

近几年研究者对Wnt/β-catenin信号通路影响大血管损伤的问题越来越重视[15]。Gordon等[16]通过对该信号通路的研究发现,它的异常是引发糖代谢紊乱的主要原因,同时使D2M风险上升,并参与高糖介导的肾上皮细胞转分化过程[17,18,19]。Wang等[20]通过针对1型糖尿病大鼠模型的一系列研究指出,在DM状态下,大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路处于激活状态。研究发现,Wnt/β-catenin信号通路对DM主动脉损伤有显著影响,而RAGE通过调节该信号通路影响多种心血管疾病发病,最终对心肌起保护作用,同时舒张血管,抑制动脉粥样硬化[21]。RAGE为晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproduct,AGE)受体,二者结合后介导细胞内一系列信号通路的激活,使得活性氧、氮类以及炎性细胞因子的形成和释放增加,产生氧化应激以及炎症反应,最终导致细胞代谢紊乱。AGE与RAGE结合能以氧化应激依赖的方式启动包括Wnt/β-catenin等在内的不同信号通路。有研究表明,AGE/RAGE轴可通过Wnt/β-catenin轴促进人主动脉平滑肌细胞的钙化。而且,RAGE过表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路及下游sFRP2表达和增强TCF4的转录活性[22]。Liu等[23]指出,当单核-巨噬细胞中的RAGE失活时,mTOR通路介导NF-κB相关信号通路激活,最终导致动脉粥样硬化的发生。张琳等[24]研究表明,RAGE过表达可激活上述信号通路,从而对细胞寿命及能量平衡产生正向调节,起到增强主动脉血管内皮细胞功能进而保护细胞的作用,同时使动脉粥样硬化的发生率下降。曾有相关报道[25]指出,肝脏缺血-再灌注损伤中,RAGE的调节可对Wnt信号通路产生一定抑制作用,进而降低氧化损伤以及细胞凋亡速度,从而达到保护肝细胞的目的。Zhou等[26]针对间充质干细胞的相关研究发现,RAGE可通过相关作用机制调节Wnt/β-catenin信号通路。但是,RAGE对心血管系统中Wnt/β-catenin信号通路的调节机制尚未明确。

本研究的Westernblotting、RT-PCR结果显示,2w、4wWnt2在D2M大鼠主动脉组织中的表达量显著上升,进而加速β-catenin核转移,TCF4等核转录因子表达量上升,说明Wnt/β-catenin信号通路被激活;而且早期部分D2M大鼠主动脉内皮细胞出现空泡变性,部分情况加重者出现细胞坏死等现象。由于D2M早期Wnt/β-catenin信号通路的内源性抑制剂RAGE表达维持在较高水平,推测Wnt/β-catenin信号通路在D2M早期主动脉组织中快速激活,体内RAGE合成率上升,sFRP2水平持续下降,对Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin进行直接调节,影响其表达水平。DM心血管并发症的主要诱因包括DM主动脉病变,确定其具体作用机制抑制其发展是目前的研究热点。

综上所述,RAGE对Wnt/β-catenin信号通路的激活具有调节作用,并通过该方式影响DM主动脉损伤程度以及相关蛋白的表达量,进而抑制动脉粥样硬化,达到保护主动脉的目的。

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基金:四川省教育厅2017年度科研计划项目(17TD0047).