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氟化钠对H9c2心肌细胞p38MAPK表达的影响

2022-04-16 221 上传者：管理员

摘要：目的:观察染氟H9c2心肌细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK) mRNA表达的变化，探讨氟化钠(NaF)致心肌损伤的潜在机制。方法:体外培养H9c2心肌细胞，并加入不同剂量NaF进行染毒处理。设定NaF染毒剂量分别为10、20、40 mg/L三组，对照组不加NaF。应用CCK-8法检测细胞活力，TUNEL染色法在荧光倒置显微镜下观察细胞形态的变化及凋亡情况，以及通过实时荧光定量PCR技术检测p38MAPK mRNA表达水平。结果:与对照组相比，随着NaF浓度增加，H9c2心肌细胞活力下降(P<0.05);不同浓度NaF处理48 h后，细胞形态发生了不同程度的改变，且出现细胞凋亡(P<0.05);与对照组相比，随着NaF浓度的增加，p38MAPK mRNA表达水平逐渐增加(P<0.05)。结论:NaF可能通过诱导p38MAPK的表达，激活p38MAPK信号通路诱导H9c2心肌细胞凋亡，进而造成心肌细胞损伤。

关键词：
H9c2心肌细胞
p38MAPK
心功能障碍
氟化钠
细胞凋亡
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氟是人体必需的元素之一，广泛存在于生物系统和外部环境中。世界卫生组织推荐氟化物的最小日摄入量不超过0.5 mg/L[1]。适量的氟摄入有益于生命体正常活动，但过量氟暴露可引起人体各器官组织损伤，如氟中毒致神经损伤[2],燃煤型氟中毒致大鼠肝损伤[3]与肾脏损伤[4]。深入研究氟中毒损伤机制发现，氟中毒会引起细胞凋亡，如氟中毒会导致大鼠肾脏、神经细胞等出现细胞凋亡[5]。研究表明，过量氟暴露可能影响心血管功能，其中从人群流行病学、动物实验及体外细胞实验等不同角度的研究显示，高氟暴露对心脏损伤、血管硬化、高血压、高血脂等心血管疾病有影响[6]。目前氟中毒致心肌细胞损伤的具体分子机制尚不十分明确。现已有研究报道，在物理、化学或应激刺激下p38MAPK被激活，在氧化应激、细胞凋亡和血管收缩等过程发挥着重要作用[7],p38MAPK被磷酸化激活后，诱导Caspase-3、Caspase-9介导的凋亡通路，进而引起细胞凋亡[8]。然而NaF是否通过诱导p38MAPK的表达，进而造成心肌细胞损伤鲜见报道。本研究通过体外培养H9c2心肌细胞，制备48 h氟染毒模型，检测不同浓度的氟化钠(NaF)对H9c2心肌细胞形态、活力及p38MAPK表达的影响，旨在观察氟中毒对H9c2心肌细胞产生的作用。

1、材料与方法

1.1细胞培养及实验分组

实验选用H9c2细胞购自北京协和医学院的细胞资源中心国家实验细胞资源共享服务平台。冻存于-80℃中备用，复苏后用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5 % CO2的细胞培养箱中培养。设定NaF染毒剂量分别为10、20、40 mg/L三组，对照组不加NaF。

1.2仪器及试剂

CO2培养箱(Thermo,美国),超速低温(Thermo,美国),冷冻离心机(Thermo,美国),NanoDroP-2000微量核酸蛋白定量仪(Thermo,美国),ELX-800全自动酶标仪(Thermo,美国),PTC-100 PCR仪(Thermo,美国),7900HT实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,美国),TE2000-U倒置相差显微镜(Nikon,日本)。NaF(大茂化学试剂厂，天津市),Cell Counting Kit-8(博士德，中国),TUNEL检测试剂盒(博士德，中国),DAB显色试剂盒(博士德，中国),反转录试剂盒(Thermo,美国),BCA试剂盒(Thermo,美国),ECL化学发光试剂(Thermo,美国)。

1.3方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞活力

收集对数期细胞制备细胞悬液，加入96孔板的对应孔中，并加入培养基，空白孔加入PBS,放于恒温培养箱内24 h。24 h后弃旧培养基，用PBS清洗。按对照组和10、20、40 mg/L NaF染毒剂量分为四组，每组5个复孔，加入培养基与对应剂量NaF,空白孔加入等体积PBS,加样好的96孔板放于5 % CO2、37℃恒温培养箱染毒培养48 h。再加入CCK-8试剂(CCK-8试剂∶处理液=1∶10),加入CCK-8试剂孵育1 h后酶标仪检测，设定酶标仪波长为450 nm,检测吸光度值并按细胞存活率=[(染氟孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%统计。实验重复3次。

1.3.2 TUNEL法检测细胞形态及凋亡

收集对数期细胞且细胞形态良好，制备细胞悬液，离心后弃上清，PBS清洗1次。将细胞接种于24孔板中的细胞爬片上，培养24 h。加入对应浓度NaF染毒，培养48 h。根据说明书处理细胞，显色。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。用荧光倒置显微镜观察。

1.3.3实时荧光定量PCR检测p38MAPK表达

细胞按分组染毒48 h后，收集细胞提取总RNA,并测定RNA浓度。根据Thermo反转录试剂盒与2×Real-time PCR Mix说明书对总RNA进行反转录并扩增。按照2-△△Ct计算基因相对表达水平，以β-actin为内参，引物序列(目的基因与内参基因引物序列),见表1。

表1引物序列

1.4统计学分析

应用Graphpad primer 6.0统计软件进行数据分析，计量资料以(x¯±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1氟化钠对心肌细胞活力的影响

与对照组相比，H9c2细胞暴露于NaF 48 h后，细胞活力降低；且随着NaF浓度的增加，细胞活力明显下降(P<0.05)。见图1。由此可以推断，长期暴露于NaF中会抑制H9c2心肌细胞的活力，并且抑制程度与染毒剂量密切相关。

图1 NaF对H9c2心肌细胞活力的影响

2.2氟化钠对心肌细胞形态与细胞凋亡的影响

在荧光倒置显微镜下观察细胞形态的变化，对照组心肌细胞间隙均匀，细胞呈长梭形，完整且明显，仅有少量凋亡表现；与对照组相比，随着NaF处理浓度增加，H9c2心肌细胞间隙增大，细胞肿胀变圆，长梭状形态不明显，呈不规则样，细胞凋亡明显增加。见图2。与对照组相比，染氟组染色阳性细胞增加(P<0.05)。见表2。

图2 NaF对H9c2心肌细胞形态的影响

表2 NaF对H9c2心肌细胞凋亡的影响

2.3氟化钠对心肌细胞p38MAPK mRNA表达的影响

H9c2心肌细胞暴露于NaF 48 h后，与对照组相比，心肌细胞中p38MAPK mRNA表达量增加，且p38MAPK mRNA表达量随NaF处理浓度的增加而增加。见图3。

图3 NaF对H9c2细胞p38MAPK mRNA表达的影响

3、讨论

适量氟可参与人体正常生命活动，然而由于快速工业化、含氟杀虫剂的使用和含氟城市水的排放，地表水的天然背景氟化物水平不断增加[9,10]。长期暴露于氟会导致机体多种器官损伤[11],过量氟会诱导细胞凋亡的发生。李新颖等[2]研究证实高剂量氟可促进线粒体的氧化应激和自噬，并诱导神经元凋亡。细胞凋亡是细胞对生理或病理刺激信号产生的一种由多基因控制的主动的细胞程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。越来越多的研究发现，氟中毒致机体损伤的发病机制可能与细胞凋亡有关[12]。大量研究证实，氟中毒导致骨相疾病的产生[13,14]。在多项非骨相损伤的研究中发现，氟易与血液中的微量元素钙、镁等相结合，使钙磷代谢平衡紊乱，从而引起一系列系统疾病[13]。随着研究的深入，发现长期氟暴露诱导心血管疾病发生[6],但目前氟中毒对心肌细胞损伤的机制仍不十分明确。在田晓琳[15]的研究中，过量氟暴露改变大鼠心脏功能及心肌组织病理及超微结构，影响心肌损伤相关酶活力和产物水平，致心脏毒性损伤。本实验结果表明，染毒H9c2心肌细胞的细胞活力降低，与其结果一致。

H9c2心肌细胞染毒组加入NaF为10、20和40 mg/L,处理48 h后，通过TUNEL法检测发现，随着NaF浓度的增加，细胞凋亡明显增加。结果说明细胞凋亡与染氟剂量相关。这与杨霞[16]的研究结果一致，其用不同浓度氟化钠对H9c2心肌细胞进行染毒培养，低剂量的氟对细胞的增殖没有明显影响，随着NaF浓度的逐渐增大，氟对细胞增殖的抑制作用逐渐增强。杨霞[16]通过HE染色法观察心肌细胞的形态变化，实验结果为对照组心肌细胞整体轮廓清晰，折光性好，细胞排列均匀，间隙小，形态自然，细胞核形态正常，处于细胞中间位置；实验组随着NaF浓度增大，细胞外形扭曲，轮廓模糊，折光性降低，细胞体积变大，间隙变宽，出现多个细胞核，细胞变形数量增多，并且观察到H9c2心肌细胞随氟剂量的增加细胞凋亡亦增加。

p38MAPK是MAPK家族中的一员，属于应激激活蛋白激酶，是丝氨酸/苏氨酸定向激酶，可被多种细胞外刺激激活，参与调控多种重要细胞活动，例如细胞凋亡、分化和细胞增殖[17]。众多学者研究中发现，激活p38MAPK信号通路可导致细胞凋亡，当抑制p38MAPK蛋白活性，可减轻大鼠心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤、心功能障碍和室性心律失常，对大鼠心肌具保护作用[18,19]。本实验结果说明，p38MAPK mRNA表达量随NaF处理浓度的增加而增加，进而提示氟可能通过诱导p38MAPK的激活而引起心肌细胞凋亡。

综上所述，过量氟暴露诱导H9c2心肌细胞发生形态损伤，抑制H9c2细胞增殖，同时对细胞产生毒性作用，使其凋亡。在此过程中，p38MAPK mRNA表达水平随NaF染毒剂量的增加显著上调，提示氟可能通过诱导p38MAPK的激活而引起心肌细胞凋亡。在今后的研究中还将进一步明确氟化钠诱导心肌细胞凋亡与p38MAPK通路的关系。

参考文献：

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[2]李新颖,于星辰,张舜,等氟中毒对神经细胞线粒体功能及凋亡的影响[J]华中科技大学学报(医学版),2021,50(5)555-560.

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[12]石雨奇,陈培清,孙安阳氟化物过量摄入对阿尔茨海默病发病的影响及其细胞分子机制[J].生命的化学,2021.41(10):2204-2214.

[13]李薛燕,黄文丽氟中毒致机体损伤及其机制[J]国外医学(医学地理分册),2015,36(3):186-189.

[14]李甜,郭琼,廖礼彬,等氟对人成骨细胞和小鼠骨组织caspase14表达影响[J].现代生物医学进展,2017.17(9):1631-1634.

[15]田晓琳亚慢性砷氟暴露对大鼠心脏毒性的影响及自噬相关基因的表达变化[D].山西:山西医科大学,2019.

[16]杨霞AMPK参与线粒体通路介导的氟致H9c2心肌细胞凋亡机制的研究[D].山西:山西医科大学, 2015.