首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 心血管内科论文 > 杜拉鲁肽对阿霉素诱导心肌细胞损伤的作用及机制

杜拉鲁肽对阿霉素诱导心肌细胞损伤的作用及机制

2024-08-08 59 上传者：管理员

摘要：目的探讨杜拉鲁肽对阿霉素所致的心肌细胞损伤的作用及其机制。方法用杜拉鲁肽和阿霉素共同孵育心肌细胞H9C2 24 h后并用CCK-8法检测H9C2心肌细胞活性，采用TUNEL染色观察H9C2细胞凋亡，二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针技术检测活性氧(ROS)水平，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测H9C2心肌细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达及氧化应激相关因子醌氧化还原酶(NQO)1、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4 mRNA表达，Western印迹检测H9C2细胞凋亡和氧化应激相关蛋白及相关信号通路蛋白表达。结果杜拉鲁肽干预上调心肌细胞Bcl-2 mRNA表达，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3蛋白表达，减少阿霉素诱导的ROS生成，促进NQO1和GPX mRNA表达，降低NOX4 mRNA表达，激活心肌细胞内磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/c-Jun氨基末端转移酶(JNK)信号通路，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论杜拉鲁肽通过活化PI3K/AKT/JNK信号通路改善阿霉素诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激，减轻心肌细胞损伤。

关键词：
DOX
心肌细胞H9c2
杜拉鲁肽
细胞凋亡
阿霉素
加入收藏

阿霉素(DOX)又称多柔比星，属于蒽环类药物，临床上广泛用于白血病、乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等多种肿瘤的化疗[1～4],但其心脏毒性是导致化疗患者预后不良的重要原因。虽然已知几种抗氧化剂，如维生素E、N-乙酰半胱氨酸等可缓解DOX引起的心肌损伤[5～8],然而疗效仍不能令人满意。因此，研究能够更有效抑制DOX引起心肌损伤的新药物非常迫切。

杜拉鲁肽作为新型的降血糖药物，属于长效胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动药，主要用于2型糖尿病的治疗，近年来临床研究发现，其能使心力衰竭患者获益[9],但杜拉鲁肽在DOX所致心脏毒性中的作用尚不清楚。本研究拟在DOX诱导心肌细胞H9C2毒性模型基础上，探究杜拉鲁肽对DOX诱导的H9C2细胞毒性作用的影响及其机制。

1、材料与方法

1.1 仪器与试剂

Synergy HT多功能酶标仪(美国Bio-tek公司);MCO-18AIC(uv)二氧化碳培养箱(日本三洋);F98荧光分光光度计(上海棱光)。杜拉鲁肽(Trulicity, 100 μmol/L),注射用盐酸多柔比星(深圳万乐药业有限公司，H44024359);改良DMEM培养基(C11995)和胎牛血清(10099)购自美国Gibco公司；CCK8试剂盒(日本同仁，CK04);Trizol试剂(Invitrogen, 15596-026);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore);化学发光蛋白检测显影液(美国Borad);GAPDH抗体(2118)、磷酸化-磷脂酰肌醇-3激酶(P-PI3K)抗体(4228S)、PI3K抗体(4257)、P-c-Jun氨基末端转移酶(JNK)抗体(4668P)、T-JNK抗体(9258)、P-AKT抗体(4060)和T-AKT抗体(4691)购自美国CST公司；剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)3抗体(T40044S)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)抗体(T40051S)和Bcl-2抗体(T40056S)购自中国Abmart公司；TUNEL试剂盒购自美国Millipore公司；二氯荧光素两乙酸盐(DCFH-DA)探针(碧云天，S0033S)。H9C2购自中国科学院细胞库。

1.2 H9C2培养

H9C2置于10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中于37 ℃,5%CO2培养箱中培养；当细胞密度达到80%～90%后，按分组给予相应刺激：①对照组：等量磷酸盐缓冲液(PBS);②DOX组DOX溶于PBS中，根据预实验结果及相关文献报道，使其终浓度为5 μmol/L[10];③杜拉鲁肽(DL)组：浓度为10、25、50、100 nmol/L;④杜拉鲁肽+DOX(DL+DOX)组：不同浓度(10、25、50、100 nmol/L)杜拉鲁肽孵育12 h的基础上加入5 μmol/L(根据预实验结果)的DOX再孵育24 h。

1.3 CCK-8法检测H9C2细胞活力

在96孔板中加入100 μl的细胞悬液培养24 h, 每组设置6个复孔，按“1.2”分组给予不同药物处理24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱中孵育4 h, 用酶标仪测定各组细胞在450 nm处的吸光度值。

1.4 TUNEL法测定细胞凋亡

将细胞接种于24孔板，经过各组相应处理后，弃培养基，4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗涤2次，运用乙醇乙酸混合液和平衡缓冲液洗涤，加入脱氧核糖核苷酸末端转移酶并在湿盒中孵育37 ℃ 1 h, 随后依次加入终止/洗脱缓冲液，抗地高辛耦联物工作液于细胞爬片湿盒中室温避光30 min, PBS洗涤，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞核，封片，并用荧光显微镜拍照。凋亡细胞比例=凋亡细胞数量/总细胞数量×100%。

1.5 Western印迹检测H9C2中蛋白表达

蛋白质提取及定量：按1.2分组接种细胞于6孔板，相应处理培养24 h后，按每孔30 ml加入蛋白裂解液[1 ml蛋白裂解液含10 μl的1 mmol/L苯甲基磺酰氟，50 μl的1 mmol/L的氯化钠，10 μl的1 mmol/L矾酸钠，100 μl Roche磷酸酶抑制剂，100 μl蛋白酶抑制剂混合物，730 μl放射免疫沉淀(RIPA)强裂解液],收集各组细胞，将细胞装于1.5 ml EP管中。随后用超声裂解仪(5 Hz)裂解细胞15～20次，并置于4 ℃离心机中12 000 r/min离心15 min。采用二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白浓度， 72 ℃水浴蛋白变性后置于-80 ℃冰箱保存。Western印迹步骤：进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),将蛋白转至PVDF膜后封闭2 h, 再加入一抗置4 ℃摇床过夜。次日，运用TBST缓冲液洗涤后，二抗孵育1.5 h, 并用化学扫膜仪进行显影。采用Image Lab软件分析蛋白条带，GADPH为内参。

1.6 实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测mRNA表达水平

RNA的提取：于接种细胞的6孔板中加入1 ml的Trizol, 静置10 min, 三氯甲烷抽提，按照200 μl/ml Trizol的比例加入三氯甲烷，室温静置5 min, 用12 000 r/min的转速4 ℃离心15 min, 离心后的上层清液为RNA,并转入新的EP管中，然后加入500 μl的异丙醇，室温静置10 min, 然后用12 000 r/min的转速4 ℃离心10 min, 弃去上清后用75%乙醇进行洗涤，离心后室温干燥10 min, 用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，并用分光光度计测定RNA浓度和纯度，置于-80 ℃冰箱中保存。RT-qPCR检测：根据LightCycler 480 SYBR Green I Master说明进行上机检测凋亡和氧化应激相关因子mRNA表达水平，GADPH用作内参。引物序列(5′-3′):GAPDH正向：GACATGCCGCCTCCAGAAAC,反向：AGCCCAGGATGCCCTTTAGT;NOX4正向：ACCTCAGTCAAACAGATGGGATA,反向：TA-GAACTGGGTCCACAGCAGA;GPX正向：GG-TTTCCCGTGCAATCAGTT,反向：GTACTTGGGGTCGGTCATGA;NQO1正向：TCCGAAGCATTTCAGGG-TCG,反向：GGGCCAATACAATCAGGGCT;Bcl-2正向：GGTGAACTGGGGGAGGATTG,反向：AGAGCG-ATGTTGTCCACCAG;Bax正向：CGTCTGCGGGGAGTCAC,反向：AGCCATCCTCTCTGCTCGAT。

1.7 细胞活性氧(ROS)水平检测

按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA孵育3 h后，PBS洗3次，尽量洗净未结合的探针，用倒置显微镜下拍照。

1.8 统计学方法

采用Graphpad9.0软件进行t检验、方差分析。

2、结果

2.1 杜拉鲁肽能够抑制DOX诱导的H9C2细胞损伤

在CCK-8实验中，与DOX组[(57.23±5.60)%]相比，给予5 μmol/L DOX+不同浓度(10、25、50、100 μmol/L)杜拉鲁肽联合干预后，细胞活力[(70.37±3.25)、(94.54±1.79)、(95.68±1.15)、(96.34±0.81)%]均明显改善，且25、50、100 μmol/L DL+DOX组细胞活力明显优于10 μmol/L DL+DOX组(均P<0.05)。说明杜拉鲁肽能够抑制DOX诱导的H9C2细胞损伤。

2.2 杜拉鲁肽能够抑制DOX诱导的H9C2细胞凋亡

与对照组相比，DOX刺激后，H9C2细胞凋亡数量显著增加(P<0.05);与DOX组比较，DL+DOX组细胞凋亡数量明显减少(P<0.05)。与对照组相比，DOX组Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著下降，Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与DOX组比较，DL+DOX组Bcl-2 mRNA及蛋白显著升高，Caspase-3蛋白表达显著下降(P<0.05);而Bax mRNA及蛋白表达各组比较无明显差异(P>0.05)。见图1、表1、图2。说明杜拉鲁肽能够通过抗心肌细胞凋亡缓解DOX所致心肌细胞损伤。

图1 各组凋亡细胞(TUNEL,×100)

与对照组比较：1)P<0.05;与DOX组比较：2)P<0.05;表2同

表1 各组凋亡细胞比例、Bcl-2和Bax mRNA及Bcl-2、Bax、Caspase-3、Bcl2/Bax蛋白表达水平比较

图2 各组细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白相对表达

2.3 杜拉鲁肽能够通过抗心肌细胞氧化应激来阻止心肌细胞损伤

与对照组相比，DOX刺激后，其DCFH-DA探针探测H9C2的ROC荧光阳性细胞明显增多(P<0.05);与DOX组相比，DL+DOX组其DCFH-DA探针探测H9C2的ROC荧光阳性细胞明显减少(P<0.05)。与对照组相比，DOX刺激后，其抗氧化因子NOQ1、GPX mRNA相对表达量显著下降，促氧化因子NOX4 mRNA相对表达量显著上调(P<0.05);DL+DOX组NOQ1、GPX mRNA相对表达量显著上调，NOX4 mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。见图3、表2。

2.4 杜拉鲁肽抗心肌细胞损伤机制

与对照组相比，DOX刺激后，其P-PI3K、P-AKT及P-JNK蛋白相对表达量显著上调，而DL+DOX组P-PI3K、P-AKT及P-JNK蛋白相对表达量与DOX组比有显著差异(P<0.05)。见表2、图4。表明杜拉鲁肽可能通过PI3K/AKT/JNK通路抑制DOX对H9C2的促凋亡作用。

图3 各组细胞ROS荧光面积比(DCFH-DA染色，×100)

表2 各组细胞ROS荧光面积占比和NQO1、GPX、NOX4 mRNA表达及P-PI3K/PI3K、P-AKT/T-AKT、P-JNK/T-JNK蛋白表达比较

图4 各组细胞P-PI3K/PI3K、P-AKT/T-AKT及P-JNK/T-JNK蛋白相对表达

3、讨论

本研究发现，杜拉鲁肽能缓解DOX诱导的H9C2细胞凋亡，并抑制DOX诱导的心肌细胞过氧化，杜拉鲁肽可能通过PI3K/AKT/JNK通路抑制H9C2细胞凋亡，从而进一步减轻DOX对H9C2的心脏毒性。

已有研究证实，DOX诱导心肌损伤主要的发病机制为DNA/RNA/蛋白质合成抑制、ROS产生增加、能量代谢受损、线粒体功能障碍、心肌细胞凋亡、间质纤维化、自噬失调和细胞内钙稳态的紊乱等[11～13]。其中，过量的ROS会诱导对生物大分子(包括脂质、蛋白质和 DNA)的氧化损伤，并破坏细胞膜的完整性和功能。此外，DOX诱发的氧化应激可通过外在和内在的凋亡途径直接或者间接引发大量心肌细胞凋亡，并导致严重的心脏功能障碍[14,15]。同时，DOX也可独立于ROS使大量心肌细胞凋亡[16]。

杜拉鲁肽作为一种新兴的降血糖药物。研究表明，杜拉鲁肽减轻LPS诱导的心肌细胞损伤[17],同时，杜拉鲁肽通过PI3K/AKT/糖原合成酶激酶(GSK)-3β来改善阿尔茨海默病的学习与记忆障碍[18]。其中PI3K-AKT途径是人体抗凋亡的内在途径，并且研究已经证实，PI3K可作为治疗的潜在靶点作用。此外，已知毒死蜱通过影响T细胞受体γ基因(TCR)γ依赖性PI3K/AKT/JNK通路诱导鲤鱼淋巴细胞凋亡和自噬[19];丹参酮ⅡA通过减弱PI3K/AKT/JNK信号通路在体内外诱导卵巢癌细胞凋亡[20]。因此推测杜拉鲁肽也可以通过PI3K/AKT/JNK信号通路来缓解DOX诱导的H9C2细胞毒性损伤。本研究发现，杜拉鲁肽可抑制DOX诱导的H9C2细胞毒性损伤，并对DOX诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激反应产生拮抗作用。通过翻译水平的检测，发现DOX刺激后PI3K磷酸化表达上调，给予杜拉鲁肽能下调PI3K磷酸化及其下游信号分子的表达，从而下调AKT、JNK磷酸化表达，从而发挥抗凋亡的效应。但本研究尚未阐述杜拉鲁肽在DOX动物模型中的作用，今后的研究工作可以就这一点进行深入探讨。

综上，杜拉鲁肽可以改善DOX诱导的H9C2细胞活性下降、凋亡和氧化应激，并可能通过激活PI3K/AKT/JNK信号通路发挥作用。

基金资助:国家自然科学基金(82170245,82370284);

文章来源:方文熙,谢赛阳,邓伟.杜拉鲁肽对阿霉素诱导心肌细胞损伤的作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(15):3696-3700.