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速率法检测血清总胆固醇浓度方法设计与方法学评价

2025-02-05 66 上传者：管理员

摘要：目的：建立速率法检测血清总胆固醇浓度的方法，并进行方法学评价，探讨其实际应用可行性。方法：配制临床可出现浓度范围的系列胆固醇标准品，通过观察不同浓度胆固醇按照胆固醇氧化酶-过氧化物酶法（COD-PAP）反应过程中呈色物质在一定波长下的吸光度变化曲线特点，绘制进程曲线。确定反应体系最佳试剂量、样本量、孵育时间、线性反应时间、K因子等参数值，制订自动化设备速率法检测血清总胆固醇的系列参数，并对其精密度、线性特点、范围、可靠性进行方法学评价。结果：确定样本量为10μL;试剂1 mL,在37°C下孵育5 s后呈色物质在510 nm波长吸光度变化进入线性期，在18 s线性反应阶段基本结束。设置测定时间分别为5 s和15 s,最终得出K因子为23.28。方法学评价显示该反应在浓度为1.32～10.00 mmol/L呈线性，各浓度绘制曲线R2均>0.99,方法精密度良好，批内变异系数（CV）值为2.62%,终点法和速率法的20组人血清总胆固醇测定结果进行配对t检验，P>0.05,差异无统计学意义，认为速率法测定血清总胆固醇浓度可接受。结论：速率法检测血清总胆固醇浓度的方法检测范围、精密度、可靠性均良好，能快速检测出结果。

关键词：
光谱分析技术
化学检测
总胆固醇
方法学评价
速率法
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临床生物化学检测技术中,自动化检测技术已被广泛应用,并极大地提高了检测结果的可比性和检测效率。自动化检测技术是保证条件控制和质量控制的重要因素,对检测结果的精密度和准确度非常必要。临床生物化学自动化检测技术主要包括光谱分析技术、电化学分析技术、离子选择电极技术及化学检测技术等。其中,体液代谢物分析检测技术主要有化学法和酶法。其中酶法被广泛使用,因为酶对底物的专一性使检测特异性得到极大的提高。胆固醇氧化酶-过氧化物酶法(COD-PAP)检测包括终点法检测、速率法检测、酶循环法。终点法检测和速率法检测是通过对反应过程中不同时间点的光谱分析结果和不同的换算关系得到代谢物的检测结果。速率法的特点是试剂消耗量小,反应时间短,对反应的条件相对严苛。自动化设备的广泛应用使得速率法容易实施,但其程序设置需要对酶偶联反应的时间进程曲线特点进行大量验证,并对各项实验参数的科学性进行大量调试验证,才能确保结果的准确性和检测范围符合生物检测范围。血清总胆固醇检测是血脂检测中重要的检测项目,总胆固醇水平是直接影响粥样斑块形成的重要因素[1]。目前,临床上检测血清中总胆固醇浓度的常规方法是通过COD-PAP酶偶联反应的终点法进行。终点法,消耗时间较长,增加了非特异性物质如维生素C等对结果的干扰。采用速率法能极大程度提高检测效率,一定程度减少干扰的影响[2]。本实验旨在探讨在终点法试剂成分不变的基础上设计速率法检测血清总胆固醇浓度的方法,确定各项参数值,参数值包括速率法对应的波长、样本量与试剂量,根据时间进程曲线确定孵育时间和检测时间,根据不同设备选择不同的吸液量。根据计算公式:胆固醇(C)=吸光度变化(△A)×因子(K),实现总胆固醇浓度的快速测定。另外,K值的确定对检测结果的准确性非常重要,但是不同的设备在相同参数下也需要通过校准程序确定最终K值,最后探讨该方法的可行性。

1、材料与方法

1.1仪器

半自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,型号:BA-88A)。

1.2试剂及配制

总胆固醇测定试剂盒(CHD-PAP法,中生北控生物科技股份有限公司,批号:20192400477)2~8℃避光保存;胆固醇标准品(中生北控生物科技股份有限公司,批号20000271)-25~15℃避光保存;胆固醇标准物质(河北百灵威超精细材料有限公司);无水乙醇;超纯水;实验室自制标准品,取5.28mmol/L的胆固醇标准品溶液适量,用超纯水分别稀释至1.32mmol/L,2.64mmol/L,3.52mmol/L和4.22mmol/L。取无水乙醇150mL,水浴加温至约55℃,称取2.00g胆固醇粉末,以无水乙醇溶解,转移至500mL容量瓶内,在25℃水浴中冷却,用无水乙醇加至500mL,混匀得到10 mmol/L的胆固醇标准品;人血清样本。

1.3程序参数值的设计

1.3.1孵育时间以及线性反应期的确立

前期经大量预实验确定反应体系:最佳试剂量为1mL,样本量为10μL,反应温度为37℃,波长为510nm,孵育时间为5s,分别取1.32 mmol/L,2.64mmol/L,3.52mmol/L,4.22mmol/L,5.28mmol/L和10.00mmol/L的胆固醇标准品溶液10μL于离心管中,加入1mL胆固醇试剂快速混匀,用生化分析仪观察反应体系吸光度值随时间变化情况,反应速度最快且呈匀速变化的时间段为线性反应期,绘制相应进程曲线。根据曲线特点确定测定时间点并求得△A。

1.3.2 K因子的校准

取1.32mmol/L和5.28mmol/L的胆固醇标准品在上述确定的参数条件下于生化分析仪中进行测定,得出线性反应期内的吸光度变化值△A,根据公式胆固醇=△A×K,计算K=C/△A,分别重复三次实验,取平均值作为最终校准K值。

1.4方法学评价

1.4.1线性范围

在生化分析仪中,以上述确定的速率法系列参数设置程序,检测各浓度胆固醇标准品,并对结果进行线性回归分析。

1.4.2精密度的验证

使用建立的速率法对浓度为5.28 mmol/L的胆固醇标准品进行浓度检测。重复进行20组实验,得出其浓度,并计算此批内变异系数(CV)值。

1.4.3可靠性验证

使用终点法和新建立的速率法分别检测20组血清样本中的总胆固醇含量,对比方法的一致性。使用SPSS22.0对两种方法结果的差值进行单样本S-W检验,判断两种方法差值是否服从正态分布,若差值服从正态分布则采用配对t检验,反之,进行配对样本的Wilcoxon符号秩和检验。

2、结果

2.1程序的建立

经上述大量实验,确定该程序系列参数:标本量10μL,试剂量1mL,反应温度37℃,波长510nm,孵育时间5s,测定时间5~15s。

2.1.1线性反应期的确定

各浓度胆固醇标准品吸光度变化值呈线性,反应速率基本保持不变,R2均>0.99,显示5~15s为线性反应期(见图1)。

图1各浓度胆固醇吸光度随时间变化曲线

2.1.2 K因子的确定

采用两点校准法分别对所有研究浓度胆固醇标准液测定510nm下5s处和15s处吸光度差值,根据K=C/△A,最终确定K值为23.28。

2.2方法学评价

2.2.1线性范围

胆固醇浓度为1.32~10.00 mmol/L,与COD-PAP试剂混合吸入至半自动生化分析仪孵育5s开始测定,绘制5~10s内胆固醇反应吸光度变化绘制曲线,R2均大于0.99,符合线性要求。

2.2.2精密度的验证

同一标本相同条件下进行20次重复测定,求得CV值为2.62%(见表1)。速率法测定血清胆固醇浓度结果精密度验证见表1,结果显示该方法精密度良好,符合临床自动化检测要求。

2.2.3可靠性的验证

对比使用传统终点法与新建速率法检测20组人血清样本中总胆固醇的含量测定结果的一致性(见表2)。使用SPSS22.0对差值进行分析,其服从正态分布。进而对两组数据结果进行配对t检验,测得两种分析方法的差异无统计学意义,配对样本检验结果显示P>0.05,按α=0.05的检验水准,不拒绝H0,尚不能认为两种方法检测总胆固醇浓度存在差异,所以认为新建立的测总胆固醇浓度速率法可接受。

表1精密度验证

表2两种方法测定结果的一致性对比

3、讨论

血脂是血浆脂质的总称,包括甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇脂以及游离脂肪酸等,与临床密切相关的血脂主要是胆固醇和甘油三酯。胆固醇是机体内重要的类固醇物质,它既是动物细胞膜的重要组成成分,又在人体钙磷代谢调节、维持神经系统正常功能中起重要作用[3-4]。在人体内,胆固醇主要以游离胆固醇及胆固醇酯的形式存在,当其合成、摄取、转化及分解等代谢过程出现异常时,可能导致体内游离胆固醇浓度发生变化,而游离胆固醇浓度的升高,在多种疾病(例如动脉粥样硬化和心脑血管等)的进展中扮演着重要角色[5]。同时,胆固醇水溶性差,必须与特殊的蛋白质即载脂蛋白结合形成血浆脂蛋白(主要为高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)才能溶于血液,被运输至组织进行代谢。低密度脂蛋白的主要功能是转运内源性胆固醇,将胆固醇从肝内运送到全身组织,增加心脑血管疾病的风险,通常被称为“坏胆固醇”。而高密度脂蛋白主要在人体的肝脏合成,具有逆向转运胆固醇的生理功能,可促进人体外周组织中胆固醇的消除,防止人体出现动脉粥样硬化的危险[6]。目前,心脑血管疾病严重威胁人类健康,是全球居民死亡的主要原因之一,动脉粥样硬化是其病理基础[7],而氧化的低密度脂蛋白是重要的致粥样硬化因子。各种刺激因素(高脂血症、低密度脂蛋白等)使内皮细胞受损而通透性改变,促使低密度脂蛋白渗透到内皮下,继而形成氧化型低密度脂蛋白,而巨噬细胞或平滑肌细胞将其吞噬后形成泡沫细胞,从而聚集形成斑块[8-9]。而受损的内皮细胞和巨噬细胞又会分泌大量的炎症因子,持续刺激会加剧炎症反应,使动脉粥样硬化持续发展[10]。因此,人体内血清总胆固醇含量的测定对心脑血管疾病的预防非常重要。目前,速率法已广泛应用于临床的一些检验项目中,而临床上检测胆固醇仍为常规的终点法。相较于胆固醇的常规检测方法,速率法能实现浓度的快速测定并提高准确度。本研究结果表明:速率法测定胆固醇浓度方法可行,可检测范围符合生物检测区间。但是由于前期试剂的使用完全与终点法测定胆固醇的试剂相同,所以实验研究表明该偶联反应进入线性反应的时间较快,即延滞期较短,线性期也较短。这样对检测设备的要求较高,有些自动化分析设备达不到条件。如果后期研究可以对试剂的浓度及组成进一步优化,有望调节时间进程特点,从而推广该方法在临床检测中被广泛使用。根据中国成人血脂异常防治指南建议,认为胆固醇含量小于5.20mmol/L为合适范围;5.20~6.20mmol/L为边缘性升高;大于6.20mmol/L为升高[11]。在临床检测血清胆固醇浓度中,异常胆固醇值甚至出现高达9mmol/L。本实验设计的总胆固醇浓度速率法所选取的浓度范围为1.32~10.00mmol/L,符合生物检测限度。在前期预实验确定的最适条件下,通过生化分析仪检测并记录各浓度胆固醇标准品线性反应期的吸光度变化值,结果显示,经孵育后10s内反应速率基本呈线性。该方法精密度高,CV值<3%,符合临床上检测要求,重复性良好。终点法和动力学法检测胆固醇浓度的方法一致性比较中,两种方法差异无统计学意义(P>0.05),一致性较高。综上认为,可接受本实验建立的速率法检测方法以及设计的参数值。同时,未来随着该方法的进一步探索和不断完善,有望在临床上使用,提高检测效率和准确度。

参考文献:

[48]郭姝,彭军.亲环素D及其介导的调节性细胞坏死[J].基础医学与临床,2017,37(11):1625-1628.

[54]石新烨,孙经武,王佳森,等.依达拉奉对心肺复苏术后心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究[J].中国现代医药杂志,2023,25(4):15-20.

[55]王娟,顾顺忠,陆洋,等.依达拉奉改善大鼠心肌缺血损伤和炎症反应[J].中南医学科学杂志,2022,50(4):495-498.

基金资助:2023年山西省大学生创新项目(项目编号:20231775);

文章来源:李颖,李晓颜,李元宏.速率法检测血清总胆固醇浓度方法设计与方法学评价[J].临床医药实践,2025,34(02):122-125+142.