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慢性粒细胞白血病中ID1表达的临床意义及其作用机制

2020-10-07 802 上传者：管理员

摘要：目的：通过分析分化抑制因子-1(ID1）在慢性粒细胞白血病（CML）中的表达及其临床意义，揭示ID1促进CML发生、发展的作用及其机制。方法：选取2016年10月至2018年4月江苏大学附属人民医院门诊及住院共35例CML患者（CML组）及19例健康供髓者（健康对照组）为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链式反应方法检测两组骨髓单个核细胞中ID1的表达水平；基因表达综合（GEO）数据库（GSE4170）分析CML不同临床分期ID1表达情况；CCK8试剂、流式细胞术检测ID1对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。结果：健康对照组中ID1的中位表达水平为0.0371,CML组中ID1的中位表达水平为0.2127,ID1在CML患者中表达上调（P<0.0001）。在GEO数据库（GSE4170）的CML不同临床分期资料中，23例慢性期（CP期）、15例加速期（AP期）和36例急变期（BC期）患者ID1的中位表达水平分别为-0.0053、0.2112和0.3416;AP期和BC期ID1患者表达水平均显著高于CP期，差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照组的K562(K562-NC）细胞相比，过表达ID1的K562(K562-ID1）细胞增殖增加，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。K562-ID1细胞的总体凋亡率低于K562-NC细胞，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：ID1在CML患者中高表达，可能通过促进细胞增殖、抑制凋亡参与CML的进展。

关键词：
临床意义
分化抑制因子
慢性髓系白血病
机制研究
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慢性粒细胞白血病（CML）是一种血液学疾病，其发病原因是造血干细胞的染色体t(9;22)(q34;q11）相互易位，导致了费城染色体（Ph+）的形成，其中BCR-ABL融合基因编码产生的BCR-ABL融合蛋白具有持续激活的酪氨酸激酶活性[1,2],BCR-ABL基因的激活可引起造血干细胞和髓系祖细胞中多种细胞内信号通路的失调，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）、两面神激酶（JAK）信号异常激活、线粒体内活性氧增多，进而导致细胞异常增殖、黏附力降低、细胞凋亡受阻及DNA修复异常[3,4,5]。根据疾病的自然进程，CML被分为三期：慢性期（CP期）、加速期（AP期）和急变期（BC期）。在此过程中，基因异常表达、基因突变和染色体异常等与CML的进展有关。

分化抑制因子-1(ID1）又称DNA结合抑制因子-1，是螺旋-环-螺旋（HLH）转录因子负性调控因子，在机体内广泛存在，在促进细胞增殖和迁移、抑制凋亡等方面起原癌基因的作用[6,7]。ID1是目前研究最热的ID分子之一，与经典的碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH）转录因子相比，其特点是保留了HLH的结构，但缺乏与DNA结合的碱性区[8]，导致ID1可以和其他bHLH转录因子相结合形成异源二聚体，不能与DNA结合以抑制bHLH转录因子对下游分子的激活作用[6]。有研究报道，ID1介导胰腺癌细胞逃逸[9];ID1通过激活肿瘤细胞中上皮细胞-间充质转化（EMT）和建立转移前微环境促进肺癌的肝转移[10]；通过整合ID1等基因表达特征和免疫表型可以改善成人B系急性淋巴细胞白血病患者预后分层[11];ID1能够通过调节AKT信号促进急性髓细胞白血病（AML）发生、发展[12]；本课题组曾报道在AML患者中ID1表达上调，高表达患者预后不良[13]。本研究拟探讨CML患者ID1表达的临床意义，分析其生物学功能，阐明其分子机制，为CML的诊断、治疗提供更多的理论基础和指导意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2016年10月至2018年4月江苏大学附属人民医院门诊及住院共35例CML患者（CML组）标本，所有患者的诊断和分期均依据《血液病诊断及疗效标准》。细胞遗传学检查采用R显带技术，按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）》进行核型分析。35例患者中位年龄48岁（22～77）岁，其中男21例，女14例。CP期、AP期及BC期患者分别为29、2例和4例。选取19例健康供髓者作为健康对照组。本研究获得江苏大学附属人民医院伦理委员会批准，并且每名研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂

流式细胞仪购自美国BD公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（RQ-PCR)7500购自美国应用生物系统公司（ABI）。1640培养基（货号：350-000-CL）购自维森特生物技术（南京）有限公司；胎牛血清（货号：EXcell-0500）购自上海依科赛生物制品有限公司。Trizol试剂购自美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen);miScriptSYBRGreenPCRKit试剂（货号：218075）和miScriptreverseTranscriptionKit试剂（货号：21816）购自凯杰企业管理（上海）有限公司（Qiagen）。CCK8试剂（货号：CK04）购自东仁化学科技（上海）有限公司；AnnexinⅤ凋亡试剂盒（AnnexinⅤ-PE/7AAD，货号：559763）购自美国BD公司。

1.2.2实验方法

1.2.2.1骨髓单个核细胞（BMMNC）分离、RNA提取和反转录

初诊患者抽取骨髓10mL，肝素抗凝，使用Ficoll密度梯度离心法分离BMMNC。总RNA应用Trizol试剂提取，并反转录为cDNA[13]。

1.2.2.2RQ-PCR检测ID1表达

目的基因ID1引物序列为5′-CTCAGCACCCTCAACGG-3′（上游）、5′-GATCGGTCTTGTTCTCCCTC-3′（下游）；选取ABL基因为内参基因，引物序列为5′-CTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′（上游）、5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′（下游），引物由北京华大基因科技有限公司合成。每次扩增反应均含阳性对照（重组ID1质粒）和阴性对照（双蒸水）。ID1表达相对定量采用2—ΔΔCT计算[13]。

1.2.2.3细胞增殖

将细胞浓度调至2.5×104mL-1，以每孔0.2mL加入96孔板，用含10%胎牛血清的1640培养液培养96h。培养结束前加入CCK8试剂，每孔20μL,5%CO2,37℃继续培养3h，酶标仪450nm检测光密度（OD）值。将ID1基因构建载体采用慢病毒转染K562细胞，并分析ID1对K562细胞增殖的影响。

1.2.2.4细胞凋亡

将1×106细胞接种于25cm2培养皿，用无血清的1640培养液培养24h，根据AnnexinⅤ凋亡试剂盒说明书染色，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.3统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计学数据分析。数据采用中位数表示。不同组间连续变量资料之间的差异采用Kruskal-Wallis检测（多组）和Mann-WhitneyU检测（两组）进行比较。不同组间分类变量资料差异采用Pearsonsχ2检验及Fisher精确检验法进行比较。采用Spearman秩相关进行相关性分析。所有分析设定P值为双侧分布，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1ID1在CML患者中的表达水平

采用RQ-PCR检测结果显示，健康对照组ID1中位表达水平为0.0371(0～1.0000),CML组ID1中位表达水平为0.2127(0～7.6860);ID1在CML患者中表达上调（P<0.0001），见图1。ID1表达与CML患者的性别、年龄、血细胞参数均无相关性（P>0.05）；核型分组间ID1表达水平比较，差异也无统计学意义（P>0.05），见表1。

图1RQ-PCR检测两组ID1表达水平

表1ID1表达程度与CML患者临床参数的关系

2.2ID1在CML不同临床分期中的表达水平

采用基因表达综合（GEO）数据库（GSE4170）资料分析CML不同临床分期ID1表达情况。23例CP期患者ID1中位表达水平为-0.0053(-0.1837～0.5214);15例AP期患者ID1中位表达水平为0.2112(-0.1537～0.9466);36例BC期患者ID1中位表达水平为0.3416(-0.6377～1.4150）。AP期和BC期患者ID1表达水平均显著高于CP期，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图2。

图2不同临床分期CML患者中ID1表达水平

2.3ID1促进K562细胞增殖、抑制凋亡

与对照组的K562(K562-NC）细胞相比，过表达ID1的K562(K562-ID1）细胞增殖增加，差异有统计学意义（P<0.05或0.01），见图3。K562-ID1细胞的总体凋亡率低于K562-NC细胞，差异有统计学意义（P<0.01）。见图4。

图3ID1促进K562细胞增殖

图4ID1抑制K562细胞凋亡

3、讨论

基因突变和染色体异常与CML的疾病进展密切相关[14,15]，然而，越来越多的研究发现其他机制也参与了这一过程[16]。本课题组曾报道DDX43通过H19和miR-186促进CML进展[17]。ID1通过抑制转录因子活性，从而抑制细胞凋亡和调节细胞增殖[12,18]。WANG等[12]报道ID1通过调控AKT信号参与白血病的发生、发展；有研究曾报道ID1在AML患者中高表达，其高表达患者预后不良[13]。但ID1在CML患者中的表达情况及其与疾病的关系目前鲜见报道。本研究采用RQ-PCR方法检测了35例CML患者和19例健康对照者中ID1的表达水平，发现ID1在CML患者中表达上调；但ID1表达与CML患者的性别、年龄、血细胞参数、核型分组间未发现有明显相关性，可能与样本量少有关。

由于本研究的CML样本中AP期患者不足3例，不满足统计分析的条件。因此，选用GEO数据库（GSE4170）资料分析CP、AP期和BC期ID1表达情况，结果显示，AP期和BC期患者ID1表达水平均显著高于CP期，提示ID1可能参与CML的疾病进展。进一步分析ID1对CML白血病细胞株K562生物学功能的影响，将ID1通过慢病毒转染K562细胞，通过流式分选和抗生素筛选获得K562-ID1细胞和K562-NC细胞，研究发现，与对照组细胞相比，ID1过表达能够促进K562细胞增殖，抑制其凋亡。

综上所述，ID1可能促进CML进展，其表达水平可作为CML患者实验室检查的潜在分子标志。

马吉春,李新雄,唐丽娟,周静东,袁畅,钱军,林江.慢性粒细胞白血病中ID1表达的临床意义及其作用机制[J].现代医药卫生,2020(18):2860-2863.