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转录因子GATA4介导电针对神经病理性痛大鼠的镇痛作用

2020-11-24 102 上传者：管理员

摘要：目的:观察转录因子GATA4是否介导电针对神经病理性痛大鼠的镇痛作用。方法:实验分两部分。第一部分将SD大鼠按照随机数字表法随机分成对照组、GATA4腺病毒干扰RNA(AV-shGATA4RNA)组和腺病毒空载体(AV-shCTRL)组,每组6只。观察大鼠脊髓GATA4蛋白表达量,评估腺病毒AV-shGATA4RNA的转染效率。第二部分将30只SD大鼠按照随机数字表法分成假手术组、模型组、电针组、电针复合AV-shGATA4RNA组、电针复合AV-shCTRL组,每组6只。采用慢性坐骨神经压迫法(CCI)制备大鼠神经病理性疼痛模型。在造模后第7天电针“足三里”“太冲”。在电针前48h,将腺病毒AV-shGATA4和AV-shCTR注射到大鼠脊髓腰(L)4—L6节段。在造模前、造模后第7天和电针后60min时检测大鼠患肢的机械痛阈值和热痛阈值;采用Westernblot法检测脊髓组织中腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量。结果:第一部分实验:对照组和AV-shCTRL组比较,大鼠脊髓GATA4蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。与AV-shCTRL组相比,AV-shGATA4RNA组大鼠脊髓GATA4蛋白表达量明显减少(P<0.05)。各组大鼠右后肢机械痛阈值与热敏痛阈值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。第二部分实验:在造模后第7天,除假手术组外,各组大鼠的机械痛阈值与热敏痛阈值较造模前明显下降(P<0.05)。在电针后60min时,与模型组比较,电针组大鼠机械痛和热敏痛阈值明显增加(P<0.05);与电针组和电针复合AV-shCTRL组比较,电针复合AV-shGATA4RNA组大鼠机械痛和热敏痛阈值明显减小(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量明显增加(P<0.05)。与模型组比较,电针组和电针复合AV-shCTRL大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量明显增加(P<0.05)。与电针组和电针复合AV-shCTRL组比较,电针复合AV-shGATA4RNA组大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量明显减少(P<0.05)。结论:电针可以增加CCI大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量;AV-shGATA4RNA可以逆转电针增加CCI大鼠脊髓腺苷A1受体蛋白表达以及电针镇痛效应。因此推测转录因子GATA4介导电针对CCI的镇痛作用,其可能的机制是GATA4调控腺苷A1受体的表达进而参与电针镇痛作用。

关键词：
GATA4转录因子
电针镇痛
神经病理性痛
腺苷A1受体
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目前,针刺镇痛的机制研究较为广泛[1],一般认为电针不仅可以通过影响神经递质比如内源性阿片类物质[2]、嘌呤物质[3,4,5]、大麻素[6]、5-羟色胺[7,8]、去甲肾上腺素[9]、多巴胺[10]等物质的释放,而且还能通过调控受体蛋白的表达来影响机体的痛阈值[11]。课题组前期研究[4,5]表明电针后60min时可以提高慢性压迫性损伤大鼠脊髓腺苷A1受体表达产生镇痛作用。腺苷A1受体是细胞膜上的一种G蛋白耦联受体,其本质是蛋白质,广泛分布在脊髓背角神经元中,激活腺苷A1受体可以抑制脊髓神经元的兴奋性,产生镇痛作用[12]。在腺苷A1受体蛋白的合成过程中,转录因子GATA4可以结合腺苷A1受体信使RNA的启动子,调控腺苷A1受体蛋白表达[13],那么针刺是否可以通过调控GATA4从而对腺苷A1受体起到调节呢?本研究观察了电针是否通过转录因子GATA4上调CCI大鼠脊髓腺苷A1受体的表达产生镇痛作用。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

健康成年雄性SPF级SD大鼠,体质量(220±20)g,动物编号:医动字第2007000517448号。动物饲养于清洁级动物房中,术前12h禁食水。所有大鼠适应动物房1个星期后进入实验。

实验分为两部分:首先将GATA4腺病毒干扰RNA(AV-shGATA4RNA)转入正常大鼠L4—L6脊髓组织中,观察大鼠脊髓GATA4蛋白表达量,评估AV-shGATA4RNA的转染效率。将18只大鼠按照随机数字表法随机分成3组:对照组、AV-shGATA4RNA组和AV-shCTRL(腺病毒空载体)组,每组6只。然后观察AV-shGATA4RNA是否可以逆转电针的镇痛效应以及对大鼠脊髓腺苷A1受体表达的影响。将30只大鼠按照随机数字表法随机分成5组:假手术组、模型组、电针组、电针复合AV-shGATA4RNA组、电针复合AV-shCTRL组,每组6只。

1.2主要试剂与仪器

高速低温离心机(德国Heraeus),高速匀浆机(常州市三盛仪器公司),无菌PE-10导管(上海玉研科学仪器有限公司),电子vonFrey测痛仪(美国IITCLifeScience),336足底测试仪(美国IITCLifeScience),4-0的含铬羊肠线(山东博达医疗用品股份有限公司),Mini-PROTEAN3电泳系统、MiniTrans-Blot转移系统(美国Bio-Rad公司),酶标仪(美国Bio-Tek公司),HANS电针仪(南京济生医疗科技有限公司)。BCA蛋白定量试剂,GATA4一抗(美国Thermo),腺苷A1受体一抗(美国Abcam),PVDF膜(美国Bio-Rad),AV-shGATA4RNA和AV-shCTRL(深圳百恩维生物科技有限公司)。

1.3造模方法

采用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,常规备皮消毒,于右侧股骨中部作切口,用玻璃分针钝性分离大鼠右下肢股二头肌,暴露出坐骨神经主干,用型号为4-0的含铬羊肠线松扎4圈,每圈间隔1mm,其打结的力度以大鼠右后肢肌肉或足趾轻微抽动最佳,采用缝合线依次缝合后,将大鼠放回鼠笼。假手术组的大鼠仅暴露右侧坐骨神经,但不打结,其余步骤与模型组相同。大鼠术后可出现足外翻,跛行走路,并出现舔舐患肢,患肢悬空不着地,安静时患肢处于防御状态等疼痛行为,视为CCI模型制作成功[14]。

1.4电针治疗方法

穴位定位参照《实验针灸学》[15]大鼠穴位图谱,“足三里”在膝关节下腓骨小头下方约5mm处,“三阴交”在后肢足背第一、二跖骨间凹陷处。用针灸针刺入大鼠患肢侧“足三里”“三阴交”,连接HANS电针仪,疏密波,频率2Hz/100Hz,电流强度1mA,持续时间为30min。

1.5鞘内置管及鞘内给药方法

在给药前3d,麻醉大鼠后,枕部剃毛、消毒、暴露枕大池,将无菌的PE-10号导管缓慢置入大鼠的蛛网膜下腔至L4—L6处。随后用20μL的微量注射器注射2%利多卡因10μL,并用10μL0.9%氯化钠溶液冲洗PE-10导管,如果大鼠出现双侧下肢暂时性瘫痪则视为置管成功。术后连续3d腹腔注射20万U青霉素用于预防切口感染。电针前严密观察大鼠是否出现神经性行为学缺陷症状,如果出现则摈弃,数量另补充。

AV-shGATA4RNA组和电针复合AV-shGATA4RNA组大鼠分别在电针前48h沿PE-10号导管注射AV-shGATA4RNA(1×1011PFU/mL,10μL),AV-shCTRL组和电针复合AV-shCTRL组大鼠分别在电针前48h沿PE-10号导管注射AV-shCTRL10μL。

1.6观察指标及检测方法

机械痛阈值测定:采用电子vonFrey测痛仪测定大鼠患后肢触诱发痛阈。在电针后60min时将大鼠随机置于铁丝网底的玻璃隔板内,安静20min以适应环境后,用探针刺激大鼠右后肢足底皮肤,当大鼠后肢因疼痛刺激迅速抬离铁丝网,或出现舔舐等行为,此时电子仪器上显示的最大数值便是机械痛阈值,测3次取平均值,每次测量间隔5min[16]。

热敏痛阈值测定:应用336甩尾足底测试仪,在电针后60min时将大鼠置于透明玻璃隔笼中,安静20min以适应环境后,测定大鼠患后肢足底的热痛反应缩足潜伏期,即为热痛阈值。同样重复测量3次取平均值,间隔5min。为了避免造成热辐射损伤,单次照射时间不超过25s[16]。

Westernblot法检测脊髓腺苷A1受体蛋白和GATA4蛋白表达:各组大鼠在完成行为学检测后处死,取出L4—L6脊髓节段,采用蛋白提取试剂盒提取脊髓组织总蛋白。配制对应浓度的分离胶和浓缩胶,取蛋白样品按顺序上样,电泳后转膜,NC膜牛血清封闭60min后,分别加入兔抗大鼠腺苷A1受体和GATA4蛋白单克隆抗体,4℃孵育过夜。室温下摇床冲洗,再加入二抗孵育,并化学发光、显影、成像。以β-actin作为内参对照。应用Alphaimager2200凝胶图像处理系统分析目的蛋白。以腺苷A1受体、GATA4蛋白条带光密度值与β-actin条带光密度值的比值表示蛋白相对表达水平。

1.7统计学方法

采用SPSS25.0软件进行统计,数据以均数±标准差(x±s)表示,腺苷A1受体蛋白、转录因子GATA4表达量采用单因素方差分析,若方差齐,则采用LSD检验进两两比较,若方差不齐,则采用Tamhane检验进行两两比较。大鼠机械痛阈值与热敏痛阈值数据采用重复测量方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1AV-shGATA4RNA对正常大鼠痛阈值及脊髓GATA4蛋白表达量的影响

各组正常大鼠右后肢机械痛阈值与热敏痛阈值比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明AV-shGATA4RNA以及AV-shCTRL不会对大鼠的痛阈值产生影响。对照组和AV-shCTRL组之间,大鼠脊髓GATA4蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05),说明腺病毒空载体对GATA4蛋白表达量无影响。与AV-shCTRL组比较,AV-shGATA4RNA组大鼠脊髓GATA4蛋白表达量明显减少(P<0.05)。见图1。

图1AV-shGATA4RNA对正常大鼠痛阈和脊髓GATA4蛋白表达量的影响

2.2AV-shGATA4RNA可以逆转电针对CCI大鼠的镇痛效应

在造模后第7天,除假手术组外,各组大鼠的机械痛阈值与热敏痛阈值较造模前明显下降(P<0.05),说明大鼠CCI模型建立成功。在电针后60min时,电针组和电针复合AV-shCTRL组大鼠机械痛阈值与热敏痛阈值较造模后第7天明显升高(P<0.05);与模型组比较,电针组和电针复合AV-shCTRL组大鼠的机械痛阈值与热敏痛阈值明显升高(P<0.05)。说明电针后60min,CCI大鼠出现明显的镇痛效应。

在电针复合AV-shGATA4RNA组中,与造模后第7天比较,电针后60min时大鼠的机械痛阈值与热敏痛阈值无明显区别(P>0.05)。在电针后60min,电针复合AV-shGATA4RNA组大鼠的机械痛阈值与热敏痛阈值较电针组和电针复合AV-shCTRL组大鼠明显降低(P<0.05),说明AV-shGATA4RNA可以逆转电针对CCI大鼠的镇痛效应。见图2。

图2各组大鼠痛阈值的比较

2.3AV-shGATA4RNA可逆转电针对CCI大鼠脊髓腺苷A1受体、GATA4蛋白表达的影响

与假手术组比较,模型组大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量明显增加(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量也明显增加(P<0.05)。与电针组和电针复合AV-shCTRL组比较,电针复合AV-shGATA4RNA组大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量明显下降(P<0.05)。见图3。

图3各组大鼠脊髓腺苷A1受体、GATA4蛋白表达的比较

3、讨论

神经病理性痛是由躯体感觉神经系统的病变或疾病引起的疼痛[17,18]17-18]。神经病理性痛不仅影响病患的工作和生活质量,同时也给社会和家庭造成较重的经济负担[19]19],大部分患者对其治疗效果非常不满意[20,21]20-21]。因此寻求一种合理的镇痛方式是很值得研究的课题。电针治疗神经病理性疼痛已经在多种疼痛模型和临床试验中得到了证实[22,23]22-23],但是其机制目前仍然没有完全明确。

GATA是基因启动子中的一段保守的碱基序列,核心碱基序列为GATA,具有高度保守的DNA结合域[24]24]。目前发现存在很多可识别GATA序列、具有调节目的基因转录活性功能的转录调节蛋白,这些蛋白被称作GATA结合蛋白家族。共发现有6种蛋白(GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA5、GATA6)组成GATA结合蛋白家族[24]24]。GATA结合蛋白都具有锌指结构,并且通过该结构与目的基因结合调控目的基因的表达[25,26]25-26]。最初发现GATA4是在心脏生长发育过程中的一个重要调节因子。随后发现GATA4通过激活血管紧张素Ⅱ型1a受体与β肌球蛋白重链等基因的表达,在心肌肥厚的发生发展中起着重要的作用[27]27]。大多数基因都包含GATA绑定序列,腺苷A1受体基因同样包含了GATA绑定序列[13]13]。有研究[13]13]表明在腺苷A1受体近端启动子中确定有GATA4结合位点,并且GATA4可以驱动腺苷A1受体的活性,并激活腺苷A1受体的表达。因此在本实验中首先观察了电针对CCI大鼠脊髓GATA4和腺苷A1受体蛋白表达的影响,研究发现,电针可以上调脊髓GATA4以及腺苷A1受体蛋白的表达量。进一步设计了腺病毒AV-shGATA4RNA,验证了AV-shGATA4RNA能够成功使正常大鼠脊髓腺苷GATA4蛋白表达沉默,并且不会对大鼠右后肢机械痛阈与热敏痛阈产生影响。然后本实验将AV-shGATA4RNA注射于CCI大鼠的L4—L6脊髓节段(腰膨大),发现AV-shGATA4RNA不仅能成功地使大鼠脊髓GATA4表达减少,同时也能减少腺苷A1受体蛋白的表达,并且AV-shGATA4RNA逆转了电针对CCI大鼠的镇痛作用。该结果验证了GATA4作为转录因子可以调控腺苷A1受体蛋白的表达,因此,推测GATA4是通过调控腺苷A1受体表达参与电针镇痛作用。

综上所述,电针能增加CCI大鼠脊髓腺苷A1受体和GATA4蛋白表达量;AV-shGATA4RNA可以逆转电针对CCI大鼠脊髓腺苷A1受体蛋白表达量的上调作用以及电针镇痛效应。因此我们推测转录因子GATA4介导电针对CCI大鼠的镇痛作用,其可能的机制是转录因子GATA4调控腺苷A1受体的表达进而参与电针镇痛作用。

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