帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是常见的慢性中枢神经系统退行性疾病,多见于40岁以上的中老年人,以静止性震颤、肌强直、运动迟缓为主要症状,以广泛出现的中枢、周围神经系统突触核蛋白异常聚集为主要病理特征,是一种多系统疾病,常伴有失眠、便秘、焦虑、抑郁等非运动症状,致残率高,严重降低患者生活质量[1,2]。PD主要致病因素包括年龄因素、环境因素、遗传因素以及多因素交互作用[3]。PD的发病机制尚未完全阐明,临床常用左旋多巴类药物治疗,但仅能够控制症状,无法有效延缓或阻止病情发展,也无法治愈,且随用药时间增长,会出现严重的不良反应及并发症[4]。因此,深入研究并阐明其致病机制,寻找新的治疗靶点、新的治疗方法或药物是PD治疗的关键。针灸作为中医学的一种治疗手段,具有成本低、无不良反应、症状缓解快等优点,不仅可以改善患者震颤、运动迟缓等症状,对非运动症状如失眠、便秘、焦虑、抑郁等效果尤为明显,能够发挥中医整体调节作用,在配合西药治疗时可减轻西药的不良反应[5,6,7]。研究电针治疗靶点及机制对确认PD的有效性及治疗方式有重要意义。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

44只SPF级健康雄性C57BL/6小鼠,8～10周龄,体质量18～22g,购自广东省医学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(粤)2018-0002,饲养于广东省中医院科学院,使用许可证号:SYXK(粤)2018-0094,每笼4～5只,温度22～25℃,相对湿度40%～70%,昼夜节律,定期供食供水。将动物随机分为正常组、模型组、美多巴组及电针组,每组11只。实验过程中对所用小鼠的饲养和各种处理均遵照《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.2主要试剂与仪器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP,美国Sigma),美多巴(上海罗氏制药有限公司),免疫组织化学试剂盒、DAB试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),Anti-TH抗体(英国Abcam),HRP标记的二抗(博士德生物工程有限公司),线粒体提取试剂盒及线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测试盒(南京建成生物工程研究所)。0.3mm×13mm针灸针(苏州环球针灸医疗器械有限公司),华佗SDZ-Ⅱ型电针治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司),多功能酶标仪(瑞士Tecan),BX53型正置荧光显微镜(日本奥林巴斯),G2SpiritTwin型透射电镜(美国TECNAI),FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD),全自动脱水仪、组织包埋机、石蜡切片机(德国Leica),R500通用型小动物气体麻醉机(深圳市瑞沃德公司生命科技有限公司),Microfuge16型台式微量离心机(美国贝克曼库尔特公司),高速冷冻离心机(安徽中科中佳公司)。

1.3模型制备方法

适应性饲养3d后,除正常组外的其他组小鼠连续5d腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的MPTP溶液(3mg/mL),给药剂量为30mg·kg-1·d-1,建立亚急性PD小鼠模型[8]。造模后小鼠爬杆时间较造模前显著延长则表明造模成功。

1.4干预方法

电针组:造模5d后利用气体麻醉装置麻醉小鼠,取双侧舞蹈震颤区,局部皮肤用75%乙醇消毒,用一次性无菌针灸针从目外眦外2mm进针(双侧),针尖朝头正中线透刺2mm,捻转行针,得气(手下沉紧,如鱼吸钩)后针柄连接电针仪,选择连续波、频率2Hz、强度0.2mA[9],电针时间15min/d,每日1次,共治疗14d。对照组:每日腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。美多巴组:用0.9%氯化钠溶液溶解美多巴,所得的混悬液以112.5mg·kg-1·d-1灌胃给药,连续14d。所有组别予同等束缚条件及相同时间气体麻醉处理。

1.5检测指标及方法

各组小鼠行为学观测:造模前对所有实验小鼠进行爬杆实验适应及训练3d,剔除运动能力不足的小鼠,观察小鼠一般状态及行为学改变,包括精神状态、活动状态、毛发情况等。将长50cm、直径2cm的外表光滑的木杆,环形缠绕包裹3层纱布防滑,垂直于水平线固定,检测时手持小鼠尾部使其头部朝向下方,前肢轻放于木杆顶端爬下,记录小鼠爬完整个木杆所需的时间,重复3次,间隔10min。记录造模前、造模后(第5天MPTP注射完成后)及治疗7、14d后各组小鼠爬杆时间,爬杆时间越长,表明小鼠出现的运动障碍程度越高。

免疫组织化学法检测小鼠中脑黑质TH表达:治疗14d后,每组选取3只小鼠,用5%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,经心脏灌流术依次灌注0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲醛,断头取脑,经脱水、石蜡包埋、切片(厚度3.5μm)、脱蜡水化,抗原修复,3%过氧化氢灭活内源性酶,5%BSA封闭,TH抗体(1∶200)孵育过夜,二抗孵育30min,经DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,低倍视野下找到中脑黑质致密区,阳性细胞可见胞质染成棕黄色或褐色,高倍视野下观察TH阳性表达情况,采集图像后计数阳性细胞数。

小鼠线粒体呼吸链复合酶活性的测定:治疗14d后,每组选取5只小鼠,5%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,经心脏灌注0.9%氯化钠溶液30mL,断头取脑。分离新鲜中脑黑质组织0.5mg,0.9%氯化钠溶液清洗,滤纸吸干,严格按照试剂盒步骤,将组织转移至EP管中,加入裂解液1,静置5min充分反应,匀浆15s,于4℃800×g离心5min;取上清于新离心管中,另取离心管加入0.5mL试剂盒中备有的溶液A,将匀浆后的上清液取其中0.5mL转移到含有溶液A的离心管中(溶液A∶上清液=1∶1),使上清液覆盖于溶液A上,置于4℃,15000×g离心10min;弃上清,加入0.2mL漂洗液,混匀,4℃15000×g离心10min;弃上清,沉淀即为组织中分离纯化的线粒体。向裂解液2中加入磷酸酶抑制剂10μL,蛋白酶抑制剂1μL,100mmol/L的苯甲基磺酰氟5μL,冰上混匀备用。以10∶1的比例向上述混合液中加入提取的线粒体,于4℃反应15min,然后于4℃16000×g离心15min,取上清即为线粒体蛋白提取物,-80℃保存备用。以上所有操作均在冰上进行。提取制备好的线粒体蛋白,经BCA法检测蛋白浓度并配平各样本浓度,严格按照试剂盒步骤,依次使用线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测试盒进行检测并计算活性。

小鼠中脑黑质线粒体膜电位的检测[10,11]:取上一步制备的新鲜中脑黑质组织,每只小鼠约取5mg,使用JC-1染料对各组小鼠中脑黑质组织中的细胞进行检测。具体步骤如下:使用超纯水以1∶160的比例稀释JC-1,涡旋混匀后以混合液∶染色缓冲液为4∶1的比例加入JC-1染色缓冲液配制JC-1染色工作液,将工作液用染色缓冲液稀释5倍备用。取新鲜中脑黑质组织,用手术刀片切成约0.5mm厚度的组织薄片置于试管,加入EDTA液5mL,室温下孵育30min,离心弃去上清;加入胰酶-EDTA液5～10mL,置于37℃恒温水浴30min,间断振荡3～5次;用300目尼龙网过滤,200×g离心沉淀5min,再以0.9%氯化钠溶液洗2～3次,(50～150)×g离心1～2min,PBS重悬,加入稀释后的工作液使JC-1终浓度为5μmol/L;使用流式细胞仪(Ex=488nm;Em=530nm)检测绿色/红色荧光比值,采集并分析数据。当线粒体膜电位水平较低时,JC-1散在为单体产生更多绿色荧光,当线粒体膜电位水平较高时,JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物产生更多红色荧光。计算绿色与红色荧光强度的比值,当比值增大时,细胞线粒体膜电位水平下降;当比值减小时,细胞线粒体膜电位水平升高。

透射电镜观察小鼠纹状体中线粒体超微结构变化:治疗结束后,每组取3只小鼠经0.9%氯化钠溶液心脏灌流后,用电镜灌注液灌注后迅速冰上断头取脑,分离纹状体,切成1mm×1mm×1mm的组织块,浸入预冷的电镜前固定液中固定24h,漂洗,后固定1.5h,梯度乙醇脱水,浸透液(丙酮∶包埋剂=1∶1)浸透1h,纯包埋剂浸透过夜,65℃,48h包埋聚合,1～2μm半薄切片对照定位后,进行60～80nm超薄切片,饱和醋酸铀、枸橼酸铅双染色,透射电镜观察,采集图像。

1.6统计方法

使用GraphPadPrism6软件进行绘图,采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,满足正态分布且方差齐,多组间比较用单因素方差分析,进一步两两比较用LSD法。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组小鼠行为学结果比较

造模后小鼠出现显著的PD样症状,包括非持续性的静止性震颤、主动运动减少、轻度的肌强直、毛发光泽暗淡、竖毛、弓背、持续翘尾、步态不稳等,并在造模后1～2周出现持续性的运动功能障碍、运动活动减少等慢性症状,正常组未出现上述症状。如图1所示,造模后模型组小鼠爬杆时间较正常组显著延长(P<0.01),提示造模成功。治疗7d及14d后,与正常组比较,模型组爬杆时间均显著延长(P<0.01);与模型组比较,电针组、美多巴组爬杆时间显著缩短(P<0.05,P<0.01)。

图1各组小鼠爬杆时间比较(x−±s,11只鼠/组)

2.2各组小鼠中脑黑质TH阳性表达的比较

与正常组比较,模型组小鼠中脑黑质神经元数量减少,排列散乱,TH阳性细胞数明显减少(P<0.01);与模型组比较,电针组、美多巴组小鼠中脑黑质TH阳性细胞数显著增加(P<0.01)。见图2。

2.3各组小鼠中脑黑质线粒体复合物Ⅰ—Ⅳ活性比较

与正常组比较,模型组线粒体复合物Ⅰ活性明显降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组、美多巴组线粒体复合物Ⅰ活性明显升高(P<0.01)。各组间线粒体复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4各组小鼠中脑黑质线粒体绿色/红色荧光百分比的比较

与正常组比较,模型组绿色/红色荧光的百分比显著升高(P<0.01)。与模型组比较,美多巴组及电针组绿色/红色荧光的百分比显著降低(P<0.01)。见图4。

2.5各组小鼠纹状体线粒体超微结构变化

正常组小鼠纹状体神经元内线粒体结构完整,呈长柱型、圆形或椭圆形,细胞质中核糖体、高尔基体及内质网等细胞器数量丰富,形态完整,排列整齐,线粒体双层膜结构清晰,脊结构丰富且排列整齐;模型组线粒体大量外膜破坏,脊结构破坏、缺损,出现多处明显空泡样变性,内质网扩张,部分细胞器边界模糊,结构破损形变;美多巴组线粒体外膜及脊结构情况改善;电针组线粒体结构完整,被破坏的线粒体明显减少。见图5。

图2各组小鼠中脑黑质TH阳性表达的比较(免疫组织化学法,x−±s,3只鼠/组)

图3各组小鼠中脑黑质线粒体复合物Ⅰ—Ⅳ活性比较(x−±s,5只鼠/组)

3、讨论

MPTP常用于灵长类动物及啮齿类动物PD相关研究[12]12]。以30mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射建立亚急性PD小鼠模型,小鼠死亡率较低,研究[8,13]8,13]表明亚急性PD小鼠模型脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失约在50%,且有显著的运动功能障碍。本研究对C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP,注射完成的1～2h内小鼠出现显著的PD样症状,包括静止性震颤、肌强直等,在连续5d的MPTP注射完成后,小鼠持续的静止性震颤仅在注射后1～2h内表现明显,之后成为一个偶发症状,持续时间短,震颤幅度较轻;之后小鼠依次出现运动减少、肌张力增高、步态异常、体质量减轻、肌力下降等长期症状,与临床上PD患者的症状发展基本一致。另外,本实验结果显示,造模后模型组小鼠爬杆时间较正常组显著增加,充分表明模型建立成功,PD小鼠出现显著运动功能障碍。但MPTP诱导的亚急性小鼠模型行为学改变具有一定自限性,其运动功能会在停止注射MPTP7d后随时间缓慢地自限性恢复,尽管如此,与模型组相比,电针组小鼠在治疗7d及14d后爬杆时间仍显著缩短,表明电针治疗可以拮抗MPTP诱导的运动功能障碍。

TH负责催化L-酪氨酸转化为多巴,而多巴是多巴胺(DA)的一个前体,因此TH是合成DA的一种重要限速酶,在PD发生、发展过程中,黑质TH含量减少是重要病理表现之一[14]14]。本研究结果表明,PD模型小鼠TH阳性表达大量减少,较好地模拟了PD的病理改变,进一步验证本次研究PD小鼠模型建立成功。相比模型组,电针组TH阳性细胞数量显著增加,表明电针治疗可以促进TH表达,对PD小鼠DA能神经元具有保护及修复作用。

图4各组小鼠中脑黑质JC-1染色绿色荧光与红色荧光比值的比较(x−±s,3只鼠/组)

图5各组小鼠纹状体中线粒体超微结构

线粒体复合物又称为线粒体呼吸链酶,主要供能是通过一系列氧化还原反应过程最终形成ATP,为机体组织提供能量,其主要位于线粒体内膜上,由5个复合物组成,线粒体复合物Ⅰ—Ⅴ[15]15]。线粒体复合物Ⅰ是呼吸链中电子传递的起始复合物,同时也是呼吸链中最复杂最主要的蛋白,含有30个以上的多肽结构,分子量远大于另外4个线粒体复合物[16,17]16-17]。线粒体复合物缺陷是导致线粒体病的主要原因之一,约占线粒体疾病的30%～40%,线粒体复合物Ⅰ的功能受损被证明与许多退行性疾病的产生相关[18]18]。大量研究[18,19,20]18-20]表明,在PD发生发展进程中由于线粒体复合物Ⅰ活性降低,跨膜电位发生改变,导致线粒体功能障碍,诱发细胞凋亡级联反应,最终导致细胞凋亡,在PD发病中占有重要地位。本研究以MPTP诱导PD模型,模型组小鼠中脑黑质TH表达显著降低,同时线粒体复合物Ⅰ活性下降,表明MPTP直接诱导了PD小鼠线粒体复合物Ⅰ活性下降,线粒体功能受损,引发严重的多巴胺能神经元损伤,进而导致PD的发生。

线粒体膜电位是线粒体内膜两侧的电位差,线粒体在进行呼吸作用产能时会将制造的电化学势能保存在内膜,使内膜两侧质子及离子浓度分布不对称,通常线粒体膜电位可作为检测细胞线粒体功能的早期指标之一[10,11]10-11]。线粒体功能障碍时往往表现为膜电位水平降低及膜通透性改变。本实验中,模型组绿色/红色荧光比值升高,表明MPTP的细胞毒性诱发了线粒体膜电位水平下降,而电针治疗可以提高线粒体膜电位水平,减轻PD小鼠线粒体功能障碍。

PD的重要病理特征是黑质纹状体DA能神经元的丢失,黑质致密部受影响最深的区域通常是腹外侧层,其神经元主要投射到纹状体背壳核,PD啮齿动物模型显示纹状体DA严重丢失,整体棘突密度降低,且随着黑质纹状体系统的退化而不断进展[21]21]。同时有证据[22]22]表明,纹状体DA能神经元的丢失要早于黑质神经元的丢失,纹状体DA传递功能障碍可能是PD黑质纹状体DA能神经元变性和死亡的早期步骤。我们通过电镜观察各组小鼠纹状体线粒体超微结构,图像显示,MPTP诱导线粒体出现大量外膜损伤,脊结构破坏、缺损,大量空泡状变性,核糖体、高尔基体、内质网等细胞器数量减少,结构破损形变,而电针组神经元形态良好,线粒体结构完整,脊结构丰富、清晰,损伤线粒体数量减少。这表明经过电针治疗后,纹状体中MPTP诱导的线粒体损伤病理改变明显减轻,并进而改善神经元、神经胶质细胞的线粒体功能。

综上所述,对PD模型小鼠行电针治疗后,小鼠中脑黑质TH表达升高,线粒体复合物Ⅰ活性升高,线粒体膜电位水平升高,同时纹状体中线粒体形态及超微结构较模型组显著改善,表明电针治疗可能通过减少PD小鼠中脑黑质DA能神经元损伤及丢失,提高线粒体复合物Ⅰ的活性,维持线粒体呼吸链功能,减轻线粒体损伤,改善纹状体神经元中线粒体超微结构,进而改善线粒体内环境及线粒体功能,对黑质纹状体DA能神经元起到保护作用。本研究为进一步研究电针效用靶点提供了方向,但其具体机制仍有待深入研究。

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