针刺治疗疾病具有整体调节作用,并具有双向的特性[1]。针刺效应的产生被认为与“神经-内分泌-免疫”网络途径密切相关,具有多环节、多靶向的特征[2]。其中,针刺效应的产生与神经系统密切相关,针刺通过刺激机体穴位引起神经传入纤维的冲动,针刺信号从外周上传至中枢神经系统后进行逐级整合和持续传递[3],反馈下行调节机制,同时促发内分泌和免疫系统,协同发挥整体调控效应。在这个过程中针刺可引起不同层级神经递质活性和水平的变化[4]。由此可见,神经系统是促发针刺效应产生的必要条件和始动因素[5]。

神经递质是神经元之间或神经元与效应器细胞之间传递信息的化学物质,也是针刺效应产生的物质基础之一。单胺类神经递质既参与腧穴局部针刺信号的启动以及针刺信息在中枢神经系统各个层级的传导和信息整合,又参与针刺对机体各个系统器官活动的调节[6]。针刺是中医学治未病的重要手段之一,能发挥未病先防和已病防变的作用,如《素问·刺热》:“肝热病者,左颊先赤……病虽未发,见赤色者刺之,名曰治未病。”足三里是针灸临床防病治病和保健强身的要穴。足三里是足阳明胃经的合穴,“四总穴”之一,也是《针灸聚英》中“回阳九针”的穴位之一。《古法新解会元针灸学》评价足三里为“此穴治病万端,有白术之强,有桂附之热,有参茸之功,有硝黄之力”。更有《千金要方》有“若要安,三里常不干”的论述。现代研究[7,8]表明,针灸刺激足三里可对机体“神经-内分泌-免疫”网络产生影响,“足三里”在机体不同状态下发挥双向调节效应,从而对机体的生理病理发挥广泛的调节作用。本课题组前期研究[9,10,11]表明,单次电针足三里能对中枢神经系统各级中枢发挥广泛的调节作用。

单胺类神经递质在中枢和外周均发挥广泛的生理学效应,也是针刺效应的介导者和发挥效应的物质基础。因此,本文通过研究正常小鼠接受电针足三里处理后不同时间节段血清中单胺类神经递质含量的变化,探索电针对正常机体外周神经递质的调节效应规律,以期部分解析针刺治未病的可能机制。

1、料与方法

1.1实验动物及分组

SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠30只,5周龄,体质量20～22 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号SCXK(沪)2017-0005。动物饲养条件为室温20～25℃,相对湿度50%～65%,每日12 h光照。实验小鼠自由饮水、普通饲料喂养。适应性饲养1周后,随机分为对照组和电针组,每组15只。实验过程中对待动物遵照国家科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2主要试剂与仪器

所有化学物质均为HPLC级,采用超纯水系统生产超纯水(Milli-Pore,美国)。标准品盐酸去甲肾上腺素(norepinephrine hydrochloride,NE)、盐酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DA)、3,4二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylaceticacid,DOPAC)、盐酸5-羟色胺(5-hydroxytryptamine hydrochloride,5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)均购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。安捷伦1200系列神经递质分析仪(南京利尔实验仪器设备有限公司),高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分工司),低温冰箱(日本SANYO公司),电化学探测器(Antec SDC ECD,荷兰),LH 200型韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司),中研太和不锈钢针灸针(0.16 mm×7 mm,天津亿朋医疗器械有限公司)。

1.3电针

用特制的棉布束缚装置对小鼠进行束缚,留小鼠双下肢在布套外,在束缚的基础上选用0.16 mm×7 mm不锈钢针灸针,75%乙醇常规消毒后直刺双侧足三里。取穴方法参考《实验针灸学》[12],通过体表解剖标志的确定以及骨度分寸法进行取穴,取双侧足三里穴,足三里定位为膝关节腓骨小头向后0.5 cm,在胫骨和腓骨之间,针刺深度7 mm。前期预实验进行电针“神经-免疫”调控相关实验时候,摸索过不同频率、强度和刺激时间,发现电针频率10 Hz,强度2 m A,留针时间30 min对神经递质和免疫均有较好的调节效应,因此采用上述电针参数。针刺刺入足三里后,接通电针仪,调节电针参数。对照组仅用特制的棉布束缚装置束缚30 min,不予电针。

1.4取材

实验前3 d,对小鼠进行环境和人为操作适应性习惯训练。采血时间点分别为电针干预前1 d及电针干预后1 h、2 h、4 h、8 h、24 h,眼眶取血。每只小鼠取150～200μL血液,室温静置1 h,3 000 r/min离心15 min,将离心后的上清液转移至新的0.5 m L EP管,再次3 000 r/min离心15 min;从每个EP管中各吸取上清液40μL。每组小鼠每3只小鼠血清混为一个样本。混样后的血清(120μL/管)加入8.6μL的高氯酸,室温静置5 min,3 000 r/min离心15 min,用移液枪吸出上清(大约为60μL/管血清),置于﹣80℃保存待测。

1.5指标检测

将所有试剂标准品分别用0.1 mol/L的高氯酸配成质量浓度为1.0 mg/m L的标准储备液,贮存于4℃冰箱内。分析时用0.1 mol/L的高氯酸稀释到所需浓度。采用高效液相色谱法测定NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及5-HT等神经递质在血清中的含量。流动相为水:甲醇为90:10(含0.74 mmol/L辛烷磺酸钠、80 mmol/L二水合磷酸二氢钠、0.027 mmol/L乙二胺四乙酸二钠和2 mmol/L氯化钾),磷酸调p H=3.0,将样品的上清液注入到C18柱(2.2μm,2.1×100 mm;赛默飞世尔科技)中,温度为38℃。用流动相磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠90 mmol/L,柠檬酸50 mmol/L,原硅酸1.7 mmol/L,EDTA 0.05μmo/L,以0.2 m L/min的流量进行分离,检测单元设置为700 m V,防护单元设置为750 m V,通过化学站(安捷伦科技)对数据进行收集和分析。通过与已知外部标准的比较,确定峰和相对浓度。NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及5-HT各分子的高效液相色谱图见图1。

1.6统计学处理

运用SPSS22.0软件对所有数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多组不同时间点比较采用重复测量双因素方差分析,若方差齐,则采用LSD检验进行两两比较;若方差不齐,则采用Tamhane’s T2检验进行两两比较。不符合正态分布的计量资料比较采用非参数检验检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及5-HT的高效液相色谱图  

2、结果

2.1两组血清NE含量比较

两组干预前小鼠血清NE含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组干预后1 h、2 h、4 h和8 h血清NE含量较干预前降低(P<0.05,P<0.01);电针组干预后24 h血清NE含量显著低于对照组和干预前(P<0.01)。详见图2。

2.2两组血清DA、DOPAC含量及DOPAC/DA比值比较

两组干预前血清DA、DOPAC含量及DOPAC/DA比值差异无统计学意义(P>0.05)。两组干预后血清DA含量和DOPAC/DA比值在各个时间点均降低(P<0.05,P<0.01),对照组干预后2 h血清DOPAC含量较干预前降低(P<0.05),电针组干预后4 h和8 h血清DOPAC含量较干预前升高(P<0.01);电针组干预后2 h、4 h、8 h和24 h血清DA含量高于对照组(P<0.05,P<0.01),DOPAC/DA比值低于对照组(P<0.01)。详见图3。

2.3两组血清5-HT、5-HIAA含量及5-HIAA/5-HT比值比较

两组干预前血清5-HT、5-HIAA含量以及5-HIAA/5-HT比值差异无统计学意义(P>0.05)。两组干预后各时间点血清5-HT含量均降低(P<0.01),电针组干预后2 h和4 h血清5-HT含量低于对照组(P<0.05);两组血清5-HIAA在各个时间点差异无统计学意义(P>0.05);对照组干预后8 h和24 h血清5-HIAA/5-HT比值较干预前降低(P<0.05),电针组干预后1 h、4 h和24 h血清5-HIAA/5-HT比值较干预前升高(P<0.01),电针组干预后1 h、4 h、8 h和24 h血清5-HIAA/5-HT比值高于对照组(P<0.01,P<0.05)。详见图4。

图2两组血清NE含量比较(,n=5)   

图3两组血清DA、DOPAC含量及DOPAC/DA比值比较(,n=5)   

图4两组血清5-HT、5-HIAA含量及5-HIAA/5-HT比值比较(,n=5)  

3、讨论

单胺类神经递质是一类由两个碳链将氨基和芳香环链接在一起为特征的神经递质或调质。单胺类神经递质在神经系统中参与了情绪、唤醒和记忆等重要生理过程的调节。同样,单胺类神经递质在外周也发挥重要生理病理调节作用。外周血中NE、DA和5-HT均有拟交感神经活性效应,对心血管系统进行调控。此外,这些单胺类神经递质在外周还有各自独特而广泛的作用和效应[13,14]。本研究发现生理状态下单次电针足三里即可对外周血中单胺类神经递质发挥广泛的影响。

NE既是一种神经递质,也是一种激素。肾上腺髓质作为一种神经内分泌转换器是外周血中NE的主要来源,其次交感节后神经元神经末梢释放的NE也有部分进入血液循环,循环系统中的NE主要通过与α型肾上腺素能受体结合发挥效应,对心血管系统和整个机体的代谢产生影响,与应激反应密切相关[15]。有研究[16]显示,电针麻醉诱导前30 min预干预,可以有效抑制腰椎后路开放手术患者气管插管即刻时外周血中的NE浓度,减少气管插管所导致的应激反应。对于急性脑梗死患者,醒脑开窍针法联合药物治疗可有效降低血清NE、5-HT水平,改善患者神经功能缺损状态[17]。而动物实验表明,常规电针刺激20 min即可引起正常兔子外周血中NE含量的下调,从而抑制交感神经活性,发挥针刺镇痛效应[18]。研究还发现,电针治疗可以通过调节心肌梗死后交感神经和副交感神经的重塑,显著降低模型小鼠血清NE水平,改善心脏功能和拮抗心肌损伤,发挥心肌保护效应[19]。本研究发现,电针组和对照组小鼠在早期外周血中NE均呈现下调,但对照组小鼠在24 h后恢复至干预前水平,而单次电针的效应可持续至针刺后24 h。

DA主要在神经元和肾上腺髓质中合成,循环血液中的DA主要受交感神经调控,但在各个组织器官也能局部合成和释放[19]。在中枢神经系统外主要通过局部旁分泌发挥作用,在心血管系统可以引起血管扩张,在肾脏中增加钠排泄和尿量,在胰腺中减少胰岛素的产生,在消化系统中减低胃肠蠕动并保护胃黏膜[20,21]。而且,近年来研究[22,23]表明外周DA在免疫调节和抑制炎症方面发挥重要作用,能够调节T淋巴细胞活性和细胞因子的释放,抑制巨噬细胞内NLRP3炎症小体依赖性的炎症反应。一项研究[24]表明电针足三里预刺激15 min可激活迷走神经,进而促进肾上腺髓质DA的合成与释放,从而抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒血症模型小鼠的全身炎症反应。DA促发人体基本运动,含量降低时肢体会出现震颤等症状,研究[25]发现针刺联合西药治疗帕金森可显著提高患者血清中DA等水平,有助于DA神经元修复,改善病情。本研究结果发现,与对照组相比,单次电针可有效提高针刺后2 h至24 h循环血液中DA的含量,且DOPAC/DA比值差异有统计学意义。但对照组和电针组之间DOPAC作为DA的代谢产物两组之间差异无统计学意义。上述结果进一步提示单次电针可以促进循环血液中DA的含量,其机制可能是电针促进了机体DA的合成和释放,但可能对DA的降解过程影响不大。

机体有1%～2%的5-HT是由中枢神经系统合成和分泌。而绝大多数5-HT是由胃肠道的肠嗜铬细胞合成并分泌入血,由血小板吸收和储存、并在激活后释放。其中5-HIAA是5-HT主要代谢产物。外周5-HT介导一系列的生理功能,包括参与调控心率、血管紧张度、肠蠕动,还能作为生长激素调控心脏、大脑和乳腺的发育以及肝、骨和肺动脉的细胞生长,也是沟通脑肠轴的关键物质基础,对免疫系统呈现广泛而复杂的调控作用[26,27]。有临床研究[28,29]显示无论是电针还是经皮穴位电刺激均能有效抑制手术患者术后外周血中5-HT的浓度,这可能是针刺治疗可以抑制患者术后恶心、呕吐和疼痛的潜在机制之一。本次实验中,虽然电针组和对照组血清5-HT和5-HIAA含量差异几乎没有统计学意义,但是5-HIAA/5-HT比值在两组中差异有统计学意义,电针组高于对照组,说明电针足三里可能同时影响机体的5-HT和5-HIAA在外周血中的分布发挥整体调控作用。上述研究结果提示针刺可能调节NE、DA和5-HT含量,可广泛应用于预防心血管系统相关疾病、降低机体应激和调节免疫抑制炎症等方面的多个病种。例如,一项双中心随机对照试验[30]发现,电针可下调血清5-HT和NE水平发挥缓解女排运动员赛前焦虑、减轻赛前压力并改善赛前焦虑引起的睡眠障碍的作用。

研究[31,32,33]表明,昼夜节律变化对机体内外周血中NE、DA和5-HT的含量有明显的影响。同时,已有的研究[34,35]就显示不同的应激刺激也可以对上述单胺类神经递质外周血中的含量产生不同的影响。且针刺作用具有显著的时间依赖效应,针刺作用可对机体产生较长时间的影响[36]。因此,本研究观察了电针对外周血24 h各单胺类神经递质含量的改变。结果发现对照组小鼠外周血中相关单胺类神经递质含量随时间的改变,这一变化可能与昼夜节律变化以及束缚刺激均有关系。由于本实验的目的是观察单次电针对外周血中单胺类神经递质含量的影响,因此未能设计相关的对照进行排除,是本次研究的不足之处。但是在不同时间点上电针组与对照组在一些相关单胺类神经递质及其代谢产物上仍然存在差异性,进一步说明电针刺激对外周血中单胺类神经递质含量具有明确的调节作用。上述研究也提示针刺作用具有明显的后效应,甚至单一1次电针刺激,其对机体的调节仍然在结束后持续较长的时间。

综上所述,本研究探索性地研究了单次电针对生理状态下小鼠外周血单胺类神经递质含量的影响,和针刺后24 h外周血单胺类神经递质的动态变化特征。这些结果不但有助于反应和解析电针足三里对正常机体启动整体调节作用的效应机制,还有助于理解针刺足三里发挥防病保健效应的原理,为中医学治未病重要思想提供一定的科学理论依据。

参考文献:

[1]赵娜娜,韩佳炜,杜元灏.针刺双向调节效应机制的研究进展[J].中国针灸,2021,41(9):1060-1062.

[2]付琳,李冀,董婉茹,等.基于“神经-内分泌-免疫”调节机制探讨针刺治疗抑郁症的研究概况[J].针灸临床杂志,2021,37(4):93-97.

[3]潘卫星.针刺双向调节效应及可能机制[J].针刺研究,2019,44(11):843-853.

[4]潘卫星.针灸的神经生物学机理[J].中华中医药杂志,2018,33(10):4281-4297.

[5]宿杨帅,李永明,景向红,等.《自然》发表的“电针驱动迷走-肾上腺轴的神经解剖学机制”一文对针灸研究的意义[J].针刺研究,2022,47(1):1-6.

[6]赵庆逸,徐玉东,尹磊淼,等.不同机体状态下针刺对神经递质的调控[J].上海中医药杂志,2020,54(10):29-34.

[7]陈坚义,唐宏图,王华,等.探议足三里[J].中医学报,2020,35(12):2521-2524.

[8]黎明,刘楠楠,张健强,等.预针刺小鼠足三里对穴区皮肤及穴旁淋巴结记忆T细胞的影响[J].成都中医药大学学报,2021,44(4):9-14.

[10]王珂,张嵘,赵国屏,等.不同频率电针对正常大鼠脊髓背角的转录组学研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(11):1508-1511,1515.

基金资助:国家自然科学基金项目(82074163,81973940);上海市针灸临床医学研究中心(20MC1920500);上海市临床重点专科项目(shslczdzk04701);

文章来源:裴丽娟,冯晨晨,姚超等.电针对正常小鼠血清单胺类神经递质的影响[J].上海针灸杂志,2023,42(11):1215-1222.