帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一种多发于中老年人群的神经退行性疾病，其确切病因尚未完全阐明。临床上，PD患者常表现为运动迟缓、步态异常、姿势失衡以及静止性震颤等症状。病理学特征包括多巴胺(dopamine, DA)能神经元凋亡和路易小体形成。现有研究证实，线粒体功能障碍在PD发病机制中发挥重要作用[1,2]。尽管药物治疗是目前PD的主要治疗手段，能够显著缓解症状，但长期用药可引发诸多不良反应。相比之下，中医针刺疗法在改善PD症状和提升预后效果方面显示出积极作用[3]。

线粒体自噬作为一种选择性自噬过程，对保护受损神经细胞和清除异常线粒体具有重要作用。研究显示，PD发病过程中线粒体自噬的激活有助于清除受损线粒体，减少细胞凋亡。此外，促进线粒体自噬可能改善PD导致的神经损伤，从而成为潜在的治疗靶点[4]。miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA,参与器官形成、细胞发育与增殖等多种生物过程，并在PD的发生发展中发挥重要作用[5]。据此，本研究基于miR-665、Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(recombinant Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)以及线粒体自噬途径探讨针刺干预PD小鼠的作用机制。

1、材料

1.1 动物

BALB/c小鼠55只，7～10周龄，体质量20～26 g, 由国科宁波生命与健康产业研究院提供，动物许可证号：SYXK(浙)2022-0039,均饲养于标准的鼠笼内(湿度45%～60%,温度20～24 ℃)。本研究严格按照动物实验标准进行操作，且获得黑龙江中医药大学附属第二医院伦理委员会审核批准，伦理审批号：中医大二院伦[2023]K10。

1.2 试剂

BCA蛋白定量试剂盒(艾美捷科技有限公司，货号：701780-480);白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，货号：AZ0004、AZ0018、AZ0014、900-TM25);ECL化学发光试剂盒[优利科(上海)生命科学有限公司，货号：Y1137S];1×TBST缓冲液(上海化邦生物科技有限公司，货号：HB21122yy);RPMI-1640培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGM31800S-500)。

1.3 仪器

组织匀浆机[格来赛生命科技(上海)有限公司，型号：DSC-400];凝胶成像系统(山东博科再生医学有限公司，型号：JY-ClearECL);电泳仪(北京北信未来电子仪器有限公司，型号：DL18-DY-301S);小动物成像系统[康森特生物科技(长沙)有限公司，型号：videotrack3.3];石蜡切片机、显微镜(北京莱博瑞杰科技有限公司，型号：JY-1508RⅢ、CX31);高速冷冻微量离心机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：M1324-M1324R)。

2、方法

2.1 PD模型制备

采用10%水合氯醛麻醉小鼠，皮下注射鱼藤酮溶液(1 mg·kg-1),每日1次，连续注射14 d。造模后，小鼠运动迟缓、反应迟钝、毛色变黄变脏、肌强直伴震颤，即为PD模型复制成功。

2.2 分组及干预

55只小鼠适应性喂养7 d后，随机选择10只作为假手术组，皮下注射生理盐水和DMSO混合液(1 mg·kg-1),剩余小鼠按照2.1项方法进行造模。将造模成功的20只小鼠随机分为模型组和针刺组，每组10只。假手术组、模型组小鼠不进行干预，针刺组小鼠给予针刺治疗，具体方法为：固定小鼠四肢和头部，清醒状态下针刺，选取关元、足三里、太冲、风府穴，采用“华佗牌”38号针灸针(0.18 mm×0.25 mm),入针时针身与皮肤需保持30°夹角，进针约2/3,快速捻针，留针30 min, 间隔5 min捻针1次，每日1次，7 d为1个疗程，1个疗程结束后暂停1 d, 2个疗程后治疗结束。

2.3 样本制备

采用10%水合氯醛麻醉小鼠，腹主动脉取血，12 000 r·min-1离心10 min, 取上清。将小鼠断颈处死，取小鼠纹状体组织，留取0.5 g, 储存于-80 ℃冰箱；剩余组织浸泡于多聚甲醛，固定24 h后，对组织进行修剪，冲洗2 h, 进行脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋，制作连续切片，厚度为 5 μm。

2.4 RT-PCR法检测小鼠纹状体miR-665 mRNA水平

取小鼠纹状体组织，提取总RNA,逆转录为cDNA。开启PCR仪，反应体系：上下游引物各0.4 μL、cDNA模板1 μL、SYBGreen 8 μL,加蒸馏水补足至25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min, 97 ℃ 10 s, 65 ℃ 35 s, 76 ℃ 15 min, 共40个循环。采用2-△△Ct法计算miR-665 mRNA的相对表达量。采用Primer 5.0软件设计引物，引物序列：miR-665-F:5′-GTTTACCTACTCGTCTCTGGTAC-3′;miR-665-R:5′-CTTATCCCAATACGTGTCGACAT-3′。

2.5 辅助性T细胞(helper T cells, TH)阳性细胞计数

取各组小鼠纹状体组织切片，于20×物镜下观察受损的侧黑质区、未受损的侧黑质区，并进行细胞计数，方向为从左到右、从上到下，不完全处在视野中的细胞不进行计数，受损、未受损的侧黑质区均记录2次，取平均值。

2.6 旷场实验检测小鼠的自主活动情况

将小鼠背对测试箱壁轻缓放入箱中(100 cm×100 cm×40 cm),适应3 min后，通过Smart 3.0小动物行为分析系统观察并记录10 min内小鼠在箱内的自主活动情况，包括总路程、平均速度、运动时间和僵滞时间百分比。每次实验完成后，取出小鼠，用酒精喷洒除味、擦干，继续检测下一只小鼠。

2.7 ELISA法检测血清炎症因子水平

取各组小鼠血清，采用酶联免疫吸附法测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平，严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作。

2.8 Western blot检测小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、自噬蛋白5(autophagy protein 5,Atg5)、苄氯素1(recombinant beclin 1,Beclin1)、BNIP3蛋白表达水平

取小鼠纹状体组织，采用BCA法测定总蛋白含量，95 ℃加热使蛋白变性，给予凝胶电泳、转膜处理。使用TBST清洗3次，快速封闭30 min; 加入一抗mito-LC 3Ⅱ、Atg5、Beclin1、BNIP3(浓度为1:1 000),4 ℃孵育过夜。使用TBST洗涤3次，每次 5 min; 加入山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(浓度为 1:1 000),室温孵育2 h。使用PBS洗膜3次，进行显影、曝光。实验重复3次，取平均值，以GAPDH作为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

2.9 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 针刺对PD小鼠纹状体miR-665 mRNA水平的影响

与假手术组比较，模型组、针刺组小鼠纹状体miR-665 mRNA水平升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组小鼠纹状体miR-665 mRNA水平降低(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠纹状体miR-665 mRNA水平比较

3.2 针刺对PD小鼠纹状体TH阳性细胞数量的影响

与假手术组比较，模型组、针刺组小鼠脑组织TH阳性细胞数量减少(P<0.05);与模型组比较，针刺组小鼠脑组织TH阳性细胞数量增加(P<0.05),见表2。

表2 各组小鼠纹状体TH阳性细胞数量比较

3.3 针刺对PD小鼠自主活动的影响

与假手术组比较，模型组、针刺组小鼠的僵滞时间百分比增加，且运动时间、速度、总路程减少(P<0.05);与模型组比较，针刺组小鼠的运动时间、平均速度、总路程增加，且僵滞时间百分比降低(P<0.05),见表3。

表3 各组小鼠旷场实验结果比较

3.4 针刺对小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8 水平的影响

与假手术组比较，模型组、针刺组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平降低(P<0.05),见表4。

表4 各组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平比较

3.5 针刺对小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、Beclin1、Atg5、BNIP3蛋白表达水平的影响

与假手术组比较，模型组、针刺组小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、Beclin1、Atg5、BNIP3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、Beclin1、Atg5、BNIP3蛋白表达水平降低(P<0.05),见表5。

表5 各组小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、Beclin1、Atg5、BNIP3蛋白表达水平比较

图1 各组小鼠纹状体mito-LC 3Ⅱ、Beclin1、 Atg5、BNIP3蛋白条带图   

4、讨论

PD是一种导致大脑内多巴胺神经元退变的神经退行性疾病，主要临床表现包括肌僵直、震颤、平衡与协调障碍以及运动迟缓等[6]。随着疾病的进展，患者可能出现认知功能障碍、抑郁、吞咽困难等并发症。PD的发病率受人群和地域的影响，存在一定差异，60岁以上人群发病率为1%～2%[7,8]。尽管针对PD的研究已广泛开展，但其确切病因尚未完全阐明，临床上亦缺乏彻底改善PD症状的治疗方案。

在中医学中，PD归属于“颤病”范畴。在辨证论治原则指导下，针刺治疗PD具有不同的针刺方案和取穴规律[9]。研究显示，针刺可显著缓解PD患者的运动异常，提升其生活质量，改善患者的平衡能力和行走速度，增强其肌肉力量[10]。此外，针刺还能有效减轻PD患者的疼痛程度，改善其他相关症状，如肌肉麻痹和肌张力异常等。研究发现，针刺干预PD的机制可能包括提升线粒体复合物活性、调节线粒体功能、减少DA能神经元凋亡、降低氧化应激反应、增强α-突触核蛋白清除率、缓解蛋白质降解系统异常等[11]。

研究表明，PD患者因脑内缺乏线粒体复合物Ⅰ,可能导致线粒体功能障碍，进而引发包括膜电位失衡、ATP生成减少、自由基产生增多、钙离子内环境稳定性受损等级联反应，最终导致DA神经元损伤，出现PD的多种临床症状[12]。线粒体作为细胞内较活跃的细胞器，通过分裂与融合形成网络结构，以保持其稳定性。研究显示，线粒体的融合与分裂障碍与PD发病存在一定的关联性[13]。线粒体自噬途径可分为2类，一类是由PINK1/Parkin介导，另一类与线粒体自噬受体蛋白相关[14]。其中，BNIP3是线粒体自噬过程中的关键分子，其表达水平异常可在一定程度上影响PD病情的发展。

miRNA具有广泛的基因调节能力，主要参与细胞增殖、分化、凋亡及周期变化等多种生物学过程。当miRNA表达出现异常，可能导致疾病发生和细胞周期失衡[15]。研究显示，miRNA在PD的发病机制中具有重要作用，如在PD患者中，纹状体、血清及黑质致密部的DA神经元miRNA表达异常[16]。目前已证实，miR-665与多种疾病的发生发展密切相关，是调节氧化应激和炎症反应的关键分子。研究发现，在2型糖尿病和食管鳞癌中，miR-665的表达异常，影响疾病进程和患者预后[17]。本研究发现，与假手术组比较，模型组小鼠纹状体miR-665表达水平升高；而与模型组相比，针刺组小鼠纹状体miR-665表达水平降低，与先前研究结果相符[18]。

神经炎症，特别是小胶质细胞介导的炎症水平异常升高被认为是PD发病及进展的重要因素。研究显示，PD动物模型中小胶质细胞被激活，导致DA神经元损伤。使用纳洛酮、米诺霉素及抗炎药物可有效改善DA神经元变性[19]。小胶质细胞一经激活，可通过促进炎症因子释放、触发氧化应激反应、引起蛋白酶功能失调以及免疫吞噬功能损伤等多重机制参与PD的发病过程。本研究发现，相较于假手术组，模型组小鼠血清炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8)水平显著上升；经针刺治疗后，上述炎症因子水平明显下降，与其他研究者报道一致[20]。

综上所述，针刺可能通过下调miR-665表达，影响BNIP3介导的线粒体自噬，从而改善PD小鼠的运动功能和炎症反应。

参考文献:

[5]李岩.lncRNA XIST靶向miR-15b-5p调控细胞凋亡及自噬参与帕金森病发病机制研究[J].徐州医科大学学报,2020,40(7):476-481.

[9]马宝锋,署文杰,孙西庆.基于数据挖掘研究现代中医治疗帕金森病用药规律[J].世界科学技术:中医药现代化,2022,8(10):4015-4021.

[10]曹媛媛,孙灵芝.帕金森病与丝裂原活化蛋白激酶信号通路的相关性及中医药干预作用[J].实用心脑肺血管病杂志,2023,9(3):117-122.

[11]李彤,孙灵芝,吴宏赟.帕金森病与炎症介质的相关性及中医药干预的研究进展[J].山东中医杂志,2022,41(9):1032-1037.

[12]王文文,邵彦江,张新乐,等.丁苯酞软胶囊通过下调miR-137促进线粒体自噬对帕金森病大鼠发挥保护作用[J].中国病理生理杂志,2021,37(12):2172-2179.

[13]王辉,任秀君,谭小宇.穿心莲内酯通过诱导线粒体自噬对实验性帕金森病小鼠改善作用研究[J].临床和实验医学杂志,2022,8(2):117-122.

[14]王春玲,罗宁,文晓东,等.乌梅总黄酮通过线粒体自噬对帕金森病大鼠的保护作用[J].西部中医药,2022,8(12):72-76.

[17]刘荣凤,张玲玲,徐志宏,等.MiR-665通过靶向调控LLGL1促进小细胞肺癌生物学行为的研究[J].中国肺癌杂志,2020,23(4):223-232.

[18]魏利娟,马亚飞,陈小莉,等.布托啡诺通过调控miR-665表达对脂多糖致心肌细胞炎症反应及细胞凋亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2022,8(2):240-245.

基金资助:黑龙江中医药管理局面上项目(ZHY2023-104);

文章来源:班维固,齐辉,卿鹏,等.针刺调控miR-665对帕金森病小鼠BNIP3介导的线粒体自噬的影响[J].中医学报,2024,39(06):1138-1143.