西南手参(Gymnadenia orchidis)为兰科手参属多年生草本植物，是珍稀藏药“旺拉”的正品入药植物之一，其根入药，具有多种药理作用[1],为青海省道地药材“十八青药”之一。西南手参分布于欧亚大陆，在我国主要生长于青藏高原海拔2 700～3 600 m无污染的灌丛和河滩中[2],萌发和生长需要与菌共生，自然繁殖困难[3],资源量极少，特别是近年来的过度采挖，导致资源锐减[4],部分传统分布区甚至面临灭绝的危险[5]。目前，西南手参已被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列为Ⅱ级珍稀药用植物，在我国也已被列入2021版“国家重点保护野生植物名录”二级保护[6]。

从药用植物内生真菌代谢产物中发现与宿主相同或相似的活性化合物，是天然药物化学研究的热点之一。植物内生真菌(endophytic fungus)寄生在植物组织中，与宿主互利共生，能够产生与宿主相同或相似的次级代谢产物，且具有快速繁殖的优点，已成为新药发现的重要源泉和发掘活性先导化合物的重要资源[7],许多临床药物或活性次级代谢产物都来源于内生真菌[8,9]。CDC25A/CDC25B磷酸酶和PD-1/PD-L1为当前公认的恶性肿瘤研究和治疗的靶点，CDC25A/CDC25B磷酸酶是细胞周期调控蛋白，其表达水平的失控会促进肿瘤细胞的生长和恶性转化；而PD-1/PD-L1为肿瘤细胞恶性增殖的免疫逃逸的重要靶点，阻断PD-1/PD-L1结合可激活免疫系统攻击肿瘤细胞，因此，筛选相关抑制剂是寻找新的抗癌药物的有效途径。基于此，作者对西南手参内生真菌进行分离鉴定，并以CDC25A/CDC25B磷酸酶及PD-1/PD-L1作为抗肿瘤活性筛选靶点，对其代谢产物的抗肿瘤活性进行筛选，以期从西南手参内生真菌代谢产物中发现免疫活性化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供帮助。

1、实验

1.1 材料

西南手参全草，2022年10月采自青海省黄南州麦秀林场(101.884 995°E,35.262 537°N,Alt.3 168 m),由青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定为西南手参(Gymnadenia orchidis)。

1.2 方法

1.2.1 西南手参内生真菌的分离

根表面灭菌：选择新鲜的西南手参健康根，依次用75%乙醇消毒60 s、0.1%氯化汞溶液消毒120 s、75%乙醇消毒30 s, 再用无菌水清洗3次。

内生真菌培养及分离：用灭菌滤纸吸干已灭菌西南手参根表面的残留水分，用手术刀纵剖，切成长约0.5 cm的小段，剖面朝下置于PDA培养基、燕麦培养基和麦麸培养基上，恒温26 ℃避光培养10 d, 每天记录菌丝的生长情况；菌种分离后，4 ℃保存，备用。以未纵剖西南手参根段作为对照，验证是否有外源菌的带入。

1.2.2 西南手参内生真菌的形态学观察

参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》,无菌条件下，用擦镜纸轻轻擦去无菌丝一面的培养物，有菌丝的一面滴入1滴溴甲酚蓝染液，静置，用倒置显微镜观察菌丝和孢子形态，详细观察每个显微结构，对菌落特征进行初步鉴定，确定菌株归属。

1.2.3 西南手参内生真菌的分子学鉴定

取1.2.1的培养菌种，超声破壁后采用CTAB法提取真菌DNA,TE缓冲液溶解，-20 ℃保存。真菌DNA采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)进行PCR扩增ITS序列。50 μL PCR扩增反应体系：2×Taqmix 25 μL,ITS1和ITS4各1 μL,gDNA 1 μL,ddH2O调整至50 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性5 s, 50 ℃退火20 s, 72 ℃延伸40 s, 40个循环。将PCR扩增产物加到琼脂糖凝胶点样孔中，上样量5 μL,70 V恒压电泳60 min后取出凝胶，用紫外凝胶成像系统观察。PCR扩增产物纯化后送上海元莘生物医药科技有限公司测序，测序结果利用MEGA 7.0软件进行序列比对并构建系统发育树。

1.2.4 内生真菌的扩大培养及代谢产物粗提物的制备

扩大培养：从斜面上挑取内生真菌菌落接种至孢子培养基中，于26 ℃、230 r·min-1振荡培养5 d; 待菌丝团长出后，吸取2 000 μL菌悬液接种至大米固体发酵培养基中，于26 ℃、230 r·min-1振荡培养10 d。

代谢产物粗提物的制备：将扩大培养物反复冻融3次，以释放细胞内产物；5 000 r·min-1离心20 min, 取上清液，浓缩，即得代谢产物粗提物，-20 ℃保存，备用。将代谢产物粗提物溶于DMSO溶液中，即得浓度为100 mmol·L-1的代谢产物试样。

1.2.5 内生真菌代谢产物的抗肿瘤活性筛选

选取CDC25A/CDC25B磷酸酶及PD-1/PD-L1(试剂盒购自CisBio公司)作为筛选靶点，利用内生真菌代谢产物粗提物筛选具有抗肿瘤活性的西南手参内生真菌菌株，作为初步的目标菌种。

(1)对CDC25A/CDC25B酶活抑制活性的筛选

CDC25A/CDC25B酶活抑制实验分为以下3组：实验组、不加代谢产物的对照组1、不加酶的对照组2。其中，实验组(18 μL):依次加入330 μmol·L-1 FDP 2.7 μL、100 μmol·L-1代谢产物1.8 μL、0.1 μmol·L-1 CDC25A/CDC25B 2 μL、FDP buffer 11.5 μL;对照组1(18 μL):依次加入330 μmol·L-1 FDP 2.7 μL、0.1 μmol·L-1 CDC25A/CDC25B 2 μL、FDP buffer 13.3 μL;对照组2(18 μL):依次加入330 μmol·L-1 FDP 2.7 μL、100 μmol·L-1代谢产物1.8 μL、FDP buffer 13.5 μL。每组实验均设2个平行。

37 ℃下，将实验组和对照组1孵育60 min后，再加入CDC25A/CDC25B,在相同条件下继续孵育60 min, 在485 nm激发光作用下，测定反应产物在520 nm处的荧光强度F520。按式(1)计算酶活存活率(%):

酶活存活率

酶活存活率越低，说明测试样品对CDC25A/CDC25B酶活的抑制活性越强。

(2)对PD-1/PD-L1结合作用抑制活性的筛选

PD-1/PD-L1结合作用抑制实验分为以下6组：实验组、阳性对照组、对照组1(positive control)、对照组2(negative control)、对照组3(cryptate control)、对照组4(buffer control)。其中，实验组(20 μL):依次加入333 nmol·L-1 Tag-1-PD-1 3 μL、33.3 nmol·L-1 Tag-2-PD-L1 3 μL、100 μmol·L-1代谢产物4 μL、0.1 μmol·L-1Anti-Tag-1-Eu 5 μL、0.1 μmol·L-1 Anti-Tag-2-XL665 5 μL;阳性对照组(20 μL):依次加入333 nmol·L-1 Tag-1-PD-1 3 μL、33.3 nmol·L-1 Tag-2-PD-L1 3 μL、100 μmol·L-1阳性化合物4 μL、0.1 μmol·L-1Anti-Tag-1-Eu 5 μL、0.1 μmol·L-1 Anti-Tag-2-XL665 5 μL;对照组1(20 μL):依次加入333 nmol·L-1 Tag-1-PD-1 3 μL、33.3 nmol·L-1 Tag-2-PD-L1 3 μL、0.1 μmol·L-1Anti-Tag-1-Eu 5 μL、0.1 μmol·L-1 Anti-Tag-2-XL665 5 μL、diluent buffer 4 μL;对照组2(20 μL):依次加入33.3 nmol·L-1 Tag-2-PD-L1 3 μL、0.1 μmol·L-1Anti-Tag-1-Eu 5 μL、0.1 μmol·L-1 Anti-Tag-2-XL665 5 μL、diluent buffer 7 μL;对照组3(20 μL):依次加入0.1 μmol·L-1Anti-Tag-1-Eu 5 μL、diluent buffer 10 μL、detection buffer 5 μL;对照组4(20 μL):依次加入diluent buffer 10 μL、detection buffer 10 μL。每组实验均设2个平行。

25 ℃下，将实验组和对照组孵育15 min后，加入Anti-Tag-1-Eu和 Anti-Tag-2-XL665,在相同条件下继续孵育120 min, 在337 nm激发光作用下，分别测定反应产物在665 nm、620 nm处的荧光强度F665、F620,并计算F665/F620。按式(2)计算抑制率(%):

抑制率越高，说明测试样品对PD-1/PD-L1结合作用的抑制活性越强，提高免疫作用的活性就越强。

2、结果与讨论

2.1 西南手参内生真菌的形态学观察结果

以PDA培养基、燕麦培养基和麦麸培养基为分离培养基，以PDA培养基为纯化培养基，采用组织块法从西南手参的根中分离得到20株内生真菌，命名为G.orc-01～G.orc-20,其形态学观察结果见表1。

由表1可知，西南手参内生真菌具有丰富的菌落形态，生长速度较缓慢，10 d左右长满整个培养基，菌落呈军绿色、灰褐色、白色或灰白色等；气生菌丝较发达，生长面有稀疏的菌丝，边缘菌丝下沉生长。

2.2 西南手参内生真菌基因组DNA提取及凝胶电泳结果

西南手参内生真菌DNA及rDNA ITS序列PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图1所示。

由图1a可知，西南手参内生真菌DNA大小超过10 kb, 显示清晰的主条带，明确了该DNA为真菌DNA,达到了PCR扩增反应的标准。由图1b可知，西南手参内生真菌DNA的PCR扩增产物大小约为500 bp, 显示为一条具有特征性的条带，与预计扩增产物大小一致，确定得到的片段是rDNA ITS片段。

表1 西南手参内生真菌的形态学观察及rDNA序列比对结果

图1 西南手参部分内生真菌DNA(a)及rDNA ITS序列PCR扩增产物(b)的凝胶电泳图谱   

2.3 西南手参内生真菌的分子学鉴定

分离得到的西南手参内生真菌PCR扩增产物经测序后，得到相应的rDNA ITS序列。利用GenBank中的BLAST进行序列比对(表1),鉴定得到20株西南手参内生真菌，分别属于镰刀菌属(Fusarium)、壳隔孢属(Camarosporium)、青霉菌属(Penicillium)、土赤壳属(Ilyonectria)、柔膜菌属(Hyalodendriella)、曲霉属(Aspergillus)、栓菌属(Trametes)、胶膜属(Tulasnellaceae)、油瓶霉属(Lecythophora)、红菇属(Russulaceae)、丝膜菌属(Cortinarius)等11个属，部分菌株的相似度不到100%,需要进行进一步全基因组测序。

在得到的西南手参内生真菌rDNA ITS序列中，与镰刀菌属相似的有5条，与青霉菌属相似的有4条。对分离得到的20株西南手参内生真菌建立N-J系统发育树，结果如图2所示。

由图2可知，20株西南手参内生真菌分属于子囊菌门(Ascomycota)及担子菌门(Basidiomycota),其中，隶属子囊菌门的真菌种类最多，共6个属。国外对手参内生真菌的研究表明，子囊菌门的盘菌目(Pez-izales)、柔膜菌目(Helotiales)、外瓶霉属(Exophiala)、Fusarium、Leptodontidium和Tetracladium的真菌也是构成手参丰富的内生真菌类群[10],表明子囊菌门为西南手参内生真菌优势菌种。

图2 西南手参内生真菌的N-J系统发育树   

2.4 西南手参内生真菌代谢产物抗肿瘤活性筛选结果

对西南手参内生真菌进行扩大培养，对其代谢产物进行抗肿瘤活性的初筛，结果见表2。

由表2可知，西南手参内生真菌菌株G.orc-10的代谢产物作用于CDC25A/CDC25B磷酸酶时，酶活存活率低于50%,说明菌株G.orc-10的代谢产物对CDC25A/CDC25B酶活的抑制作用较强，具有较高的抗肿瘤活性；菌株G.orc-05、G.orc-06的代谢产物对PD-1/PD-L1结合作用具有很高的抑制活性，可能具有较高的免疫增强活性，有望在抗肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。

2.5 讨论

西南手参是珍稀药用兰科植物，在强身健体、益智安神、防治阿尔茨海默病等方面疗效显著，尤其在开发新型防治阿尔茨海默病药物和抗肿瘤药物方面具有广阔的应用前景。本研究通过对西南手参根部内生真菌进行分离纯化、形态学及分子学鉴定，分离得到20株内生真菌，分属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)等11个属，其中隶属子囊菌门的真菌种类最多，共6个属，表明子囊菌门为西南手参内生真菌优势菌种。子囊菌门中的盘菌目(Pezizales)和柔膜菌目(Helotiales)的真菌构成手参根内丰富的内生真菌，在兰科植物中较为常见。菌株G.orc-05属于柔膜菌目，菌株G.orc-06属于曲霉菌目，菌株G.orc-10属于鸡油菌目，这3个菌株具有较高的抗肿瘤活性，值得进一步研究。

表2 西南手参内生真菌代谢产物的抗肿瘤活性筛选结果/%

实验证明，内生真菌能产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物[11],兰科植物是典型的真菌共生物种，开展西南手参内生真菌代谢产物研究具有重要意义。研究表明，大量结构新颖且具有抑制肿瘤细胞活性的物质在兰科植物内生真菌代谢产物中被发现[12,13],因此兰科植物内生真菌代谢产物具有开发为抗肿瘤新药的潜力。本研究通过CDC25A/CDC25B酶活抑制实验，对20株西南手参内生真菌代谢产物进行体外抗肿瘤活性研究，结果表明，有1株内生真菌代谢产物使CDC25A/CDC25B酶活存活率低于50%,表明其具有较高的CDC25A/CDC25B酶活抑制活性；通过抑制PD-1/PD-L1的结合来避免免疫逃逸的肿瘤免疫治疗是当前抗肿瘤研究的热点[14,15,16],本研究通过PD-1/PD-L1结合作用抑制实验，对西南手参内生真菌代谢产物进行了进一步体外抗肿瘤活性研究，结果表明，有2株内生真菌代谢产物对PD-1/PD-L1结合作用具有很高的抑制活性，说明其能够很好地抑制PD-1/PD-L1的结合，可能具有较高的增强免疫的活性。

3、结论

对西南手参内生真菌进行了分离鉴定，20株内生真菌分别属于镰刀菌属(Fusarium)、壳隔孢属(Camarosporium)、青霉菌属(Penicillium)、土赤壳属(Ilyonectria)、柔膜菌属(Hyalodendriella)、曲霉属(Aspergillus)、栓菌属(Trametes)、胶膜属(Tulasnellaceae)、油瓶霉属(Lecythophora)、红菇属(Russulaceae)、丝膜菌属(Cortinarius)等11个属。其中，菌株G.orc-10的代谢产物对CDC25A/CDC25B酶活具有明显的抑制活性，菌株G.orc-05、G.orc-06的代谢产物对PD-1/PD-L1结合作用具有明显的抑制活性，可能具有较高的增强免疫活性。揭示西南手参内生真菌代谢产物可能具有抗肿瘤药物筛选潜力，为从西南手参内生真菌代谢产物中发现抗肿瘤药物提供了科学依据。

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基金资助:青海省应用基础研究项目(2022-ZJ-739);

文章来源:张金魁,陈卫东,林鹏程,等.西南手参内生真菌的分离鉴定及其代谢产物抗肿瘤活性筛选[J].化学与生物工程,2024,41(04):44-49.