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冬凌草甲素逆转肝癌裸鼠移植瘤索拉非尼耐药的研究

2025-01-07 60 上传者：管理员

摘要：目的:探讨冬凌草甲素体内逆转人肝癌Bel-7402/Sora耐药细胞株裸鼠移植瘤耐药效应及其可能机制。方法:采用浓度梯度递增法建立Bel-7402/Sora耐药细胞株。取BALB/c雌性裸鼠40只，皮下接种Bel-7402/Sora细胞，建立Bel-7402/Sora裸鼠移植瘤耐药模型；按照随机数字表法分成8组，即模型组，冬凌草甲素高、中、低剂量组，索拉非尼组和5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组，每组5只。模型组给予生理盐水灌胃，冬凌草甲素高、中、低剂量组给予75、50、25 mg/(kg·d)冬凌草甲素溶液灌胃，索拉非尼组给予索拉非尼120 mg/(kg·d),索拉非尼+冬凌草甲素高、中、低剂量组给予索拉非尼120 mg/(kg·d)+冬凌草甲素75、50、25 mg/(kg·d)溶液灌胃，每日1次，连续14 d。观察各组裸鼠瘤重、瘤体积，计算抑瘤率，实时荧光定量PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平，WB法检测各组肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平。结果:与模型组相比，除冬凌草甲素低剂量组外，其余各组裸鼠的瘤重、瘤体积显著降低(P<0.01或P<0.05),各给药组的抑瘤率为12.35%～73.40%。荧光定量PCR法检测显示，与模型组相比，各给药组裸鼠肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量不同程度降低(P<0.01或P<0.05),各给药组PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。结论:冬凌草甲素可抑制Bel-7402/Sora裸鼠移植瘤生长，其逆转耐药机制可能与干预PI3K/AKT通路，降低PI3K、Akt、mTOR的mRNA及蛋白表达有关。

关键词：
PI3K/Akt信号通路
冬凌草甲素
耐药
肝癌
裸鼠
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索拉非尼是新型多靶点抗肿瘤药物，对于晚期肝细胞癌有效，但长期用药易导致继发性耐药。祖国传统中草药冬凌草具有清热解毒、抗肿瘤等功效[1]。课题组研究发现，冬凌草提取物冬凌草甲素可通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制肝癌细胞增殖[2-3],通过干预Hippo信号逆转肝癌细胞5-FU化疗耐药[4]。本研究旨在模拟人体内肿瘤生长环境，进一步研究冬凌草甲素逆转肝癌索拉非尼耐药的机制，为临床冬凌草治疗肝癌耐药患者提供理论依据。

1、材料

1.1 实验药物

冬凌草甲素(Oridonin, CAS:28957-04-2,批号：FB17B001)(纯度≥99%),购于成都普思生物科技股份有限公司；甲苯磺酸索拉非尼片(Sorafenib):青峰医药集团，批号：210609。

1.2 细胞株与实验动物

人肝癌细胞株Bel-7402,来源于中科院上海细胞库，本实验室液氮保存。4～6周龄BALB/c雌性裸鼠40只，体质量14～16 g, 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(沪)2002-0004。

1.3 主要试剂和仪器

逆转录试剂盒：TaKaRa公司，批号：AK22355A;PI3K、Akt、mTOR、EF-1α引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；荧光定量PCR试剂盒：TaKaRa公司，批号：AK31128A;PI3K、Akt、mTOR、GAPDH兔多克隆抗体：杭州戴格生物技术有限公司，批号：Q0322、W1228P、Q0308、P1020。DFC 7000T型倒置显微镜：德国Leica公司；Step One Plus荧光定量PCR仪：ABI公司；WES全自动蛋白定量分析仪：美国Protein Simple公司。

2、方法

2.1 人肝癌BEL-7402/Sora耐药细胞株的建立

人肝癌Bel-7402细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。采用浓度梯度递增法建立Bel-7402/Sora耐药细胞株。以浓度为1 μmol /L索拉非尼作为初始诱导浓度，每2～3 周提升浓度约1.5倍，最终得到稳定的能耐受4 μmol /L索拉非尼的Bel-7402/ Sora耐药细胞株。将细胞置于0.2 μmol /L索拉非尼培养液中培养，以维持其耐药性。于实验前1周，将耐药细胞恢复至正常培养液中培养，进行后续实验。

2.2 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立及分组给药

取对数生长期的Bel-7402/Sora细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/mL,接种至裸鼠右腋皮下，0.2 mL/只，共40只。接种后3 d开始观察成瘤情况，当肿瘤肾生长至100 mm3左右时，随机分成8组，即模型组，冬凌草甲素高、中、低剂量组[75、50、25 mg/(kg·d)]、索拉非尼组[(120 mg/(kg·d)]、索拉非尼+冬凌草甲素高、中、低剂量组，每组5只，灌胃给药，每日1次，连续14 d。

2.3 观察指标

2.3.1 体质量及移植瘤生长情况

每周测量1次裸鼠体质量，每隔3 d分别用游标卡尺测量移植瘤最大长径(a)及横径(b),计算瘤体积，肿瘤体积V(mm3)=1/2ab2,并绘制肿瘤生长曲线。实验结束时完整剥取瘤体，称瘤重，计算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

2.3.2 RT-PCR法检测肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR mRNA表达

取裸鼠肿瘤组织(80～100㎎),液氮研磨，Trizol法提取总RNA,按照试剂盒说明进行逆转录反应和Real-time PCR检测。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 4 ℃保存。PCR 反应条件：95 ℃,30 s; 95 ℃,5 s, 60 ℃,30 s, 40个循环；熔解曲线95℃,15 s, 60℃,60 s, 95℃,15 s。PI3K上游引物5’-GGAATGTCGGGAGCAGCAACC-3’,下游引物5’-TCTACCACTACGGAGC AGGCATAG-3’;Akt上游引物5’-TCAGGATGTGGATCAGCGAGAGTC-3’,下游引物5’-AGGCAGCGGATGATAAAGGTGTTG-3’;mTOR上游引物5’-ACCGT CCGCCTTCACAGATACC-3’,下游引物5’-GCAGTCCGTTCCTTCTCCTTCTT G-3’;内参EF-1α上游引物5’-CGAGC CACCATACAGTCAGA-3’,下游引物5’-CCATTCCAACCAG AAATTGG-3’;采用相对定量分析方法(2-ΔΔCt法)进行分析。

2.3.3 Western Blot法检测肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR的蛋白表达水平

取上述裸鼠(80～100 mg)用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照WES全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明，用WES全自动蛋白定量分析仪进行检测，PI3K抗体、Akt抗体、mTOR抗体(一抗，1∶20稀释),GAPDH抗体(内参，1∶200稀释),并用Compass软件进行峰面积(Peak area, PA)的分析，蛋白相对表达水平用PA目标蛋白/PA内参蛋白比值表示。

2.4 统计方法

各组数据用

表示，多组间比较采用方差分析。所有数据均由SPSS 19.0统计软件进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1 冬凌草甲素对裸鼠体质量和移植瘤生长的影响

见表1～表3,图1。

表1 各组裸鼠体质量变化比较

表2 各组裸鼠瘤重与抑瘤率比较

3.2 冬凌草甲素对裸鼠移植瘤组织PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的影响

与模型组相比，各给药组的PI3KmRNA相对表达量均有降低，其中冬凌草甲素高、低剂量组、合用高、中、低剂量组有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比，各给药组的Akt mRNA相对表达量均有下降，除冬凌草甲素中剂量组外，其余给药各组的Akt mRNA相对表达量显著低于模型组(P<0.05)。与模型组相比，各给药组的mTOR mRNA 相对表达量有所降低，其中冬凌草甲素高、中剂量组、合用高剂量组的mTOR mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。见图2。

表3 各组裸鼠移植瘤体积变化比较

图1 各组裸鼠移植瘤生长曲线

3.3 冬凌草甲素对裸鼠移植瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响

与模型组相比，除冬凌草甲素低剂量组外，其余各给药组的PI3K蛋白相对表达量显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组相比，合用高、中剂量组的Akt蛋白相对表达量显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组相比，各给药组的mTOR蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)。见图3。

图2 各组裸鼠瘤组织PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量比较

图3 各组裸鼠瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量比较

4、讨论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌的发病率和病死率较高，发病数约占全球的46.71%,粗死亡率是全球的 2.54倍[5]。临床上大多数HCC患者明确诊断时，已进入中晚期，失去了最佳的手术时机。而化疗有效率低，肝动脉化疗栓塞(TACE)治疗，不能解决远处转移的问题。索拉非尼是新型多靶点口服抗肿瘤药物，对于晚期无法手术切除或者出现远处转移的肝细胞癌有效，但长期用药易导致肝癌细胞对药物敏感性降低，产生继发性耐药，平均延长患者生存期只有3个月[6]。

研究发现，PI3K/AKT信号通路活化在肝癌索拉非尼耐药机制中起重要作用。Chen KF等[7]通过间歇诱导法，使肝癌细胞系 Huh7 在索拉非尼的作用下诱导建立分子靶向药物的耐药模型，首次研究表明 PI3K/AKT 信号通路活化促进肝癌耐药。有研究证实，PI3K/AKT通路的激活参与了HCC中EMT表型的表达，最终引起 HCC索拉非尼耐药[8]。由于PI3K/AKT信号通路在肝癌索拉非尼耐药中的重要作用，针对这一信号通路抑制剂研发逆转肝癌索拉非尼耐药成为治疗的一个研究思路。目前已有多种PI3K/AKT 信号通路抑制剂[9-11],其研发不仅需花费大量人力物力，而且因患者耐受性差和严重的毒副作用，使其进入临床使用有限。因此，临床迫切需要开发更有效、低毒、患者可耐受的PI3K/Akt信号通路抑制剂。

中药冬凌草，又名冰凌草，味甘苦，性微寒，具有清热解毒、活血止痛等功效，其中冬凌草甲素是冬凌草抗肿瘤的主要活性成分。有研究发现，冬凌草甲素能逆转SGC7901/DDP 对 DDP 耐药并诱导凋亡，其机制可能是通过下调多药耐药蛋白 P-gp、MRP1 及抑制 CIP2A/AKT 信号级联[12]。一定浓度的ORI在体外能有效抑制骨髓瘤细胞H929的增殖，并诱导细胞凋亡，其分子机制可能与上调MAPK及下调PI3K/AKT 信号通路相关蛋白有关[13]。本实验研究显示，冬凌草甲素及联合索拉非尼各组对人肝癌BEL-7402/Sora耐药细胞株裸鼠移植瘤模型进行干预处理，与模型组相比，除冬凌草甲素低剂量组外，其余各组的瘤重、瘤体积显著降低(P<0.01或P<0.05),给药各组的抑瘤率为12.35%～73.40%。荧光定量PCR法检测显示，与模型组相比，各给药组肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR的mRNA相对表达量不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比，各给药组瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。

综上，冬凌草甲素在肝癌裸鼠移植瘤体内能逆转索拉非尼耐药，抑制耐药细胞移植瘤的生长，其机制可能与干预PI3K/AKT通路及其相关蛋白表达有关。该结论为临床应用冬凌草抗肿瘤提供了有力的客观依据。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药技术出版社,2015:115-116.

[2]史国军,叶兴涛,屠小龙,等.冬凌草甲素对肝癌细胞增殖的抑制作用及其对E-cadherin､Vimentin表达的影响[J].中国中医药科技,2019,26(4):526-529.

[3]叶兴涛,徐永亦,施航,等.冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖侵袭的抑制作用及细胞Wnt2/β-catenin表达的影响[J].中华中医药学刊,2019,37(3):684-687.

[4]史国军,王永生,何国浓,等.冬凌草甲素对肝癌BEL-7402/5-FU细胞增殖､凋亡､细胞周期及Hippo信号通路的影响[J].中国中医药科技,2023,30(4):666-670.

[5]应倩,汪媛.肝癌流行现况和趋势分析[J].中国肿瘤,2020,29(3):185-191.

[11]王梦华,卢均坤.PI3K/AKT信号通路及其抑制剂的研究进展[J].医学信息,2018,31(10):34-36.

[12]何中维,肖香玲,蔡芬冬,等.凌草甲素逆转人胃癌细胞 SGC 7901/DDP 顺铂耐药的作用及机制研究[J].湖北医药学院学报,2016,35(3):261-265.

[13]常小刚,季鸥,姚浩,等.冬凌草甲素诱导人多发性骨髓瘤 H929 细胞增殖和凋亡实验研究[J].中国实验血液学杂志,2019,27(2):458-463.

基金资助:浙江省宁波市自然科学基金项目(2021J305);第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函[2022]1号);国家中医优势专科(肿瘤科)(202427);

文章来源:史国军,叶兴涛,何国浓,等.冬凌草甲素逆转肝癌裸鼠移植瘤索拉非尼耐药的研究[J].中国中医药科技,2025,32(01):48-53.