地菍别名地稔、铺地稔等，为野牡丹科植物地菍MelastomadodecandrumLour.的全草，分布于长江以南的广西等省区，资源丰富，是广西民间常用草药，其味甘、微涩，性微凉，具有清热解毒、活血止血等功效。课题组前期发现[1,2,3,4,5,6],地菍提取液能调节实验性高脂血症小鼠的血脂紊乱现象，而对正常小鼠空腹血糖无影响，并且对糖尿病大、小鼠模型均有体质量减轻的作用，具有潜在的抑制肥胖作用，但目前还未见关于地菍总黄酮对高脂饮食诱导肥胖大鼠的干预作用及机制报道。因此，本实验参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》,在给予高热量、高脂食物诱发大鼠肥胖的同时以地菍总黄酮干预，考察体质量、血脂等生理生化指标改变，同时考察该成分对肥胖大鼠肠道菌群的影响，为将其开发成减肥降脂产品提供依据。

1、材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，85只，体质量180～200g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002。

1.2 药材及饲料

地菍购自南宁小瑶王药店，由广西中医药大学药学院药用植物教研室的梁子宁教授鉴定为地菍MelastomadodecandrumLour.的干燥全草。按照黄馨慧等[7]报道的方法，药材粉碎后用50%乙醇提取，滤液减压浓缩后经AB-8大孔树脂纯化，蒸干后得到粉末备用，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定其质量分数为71.3%。普通饲料由上海斯莱克实验动物有限公司提供；高脂饲料参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》,由实验室自行制作，配方为蔗糖15%、猪油15%、蛋白粉10%、胆固醇1%、胆酸钠0.2%、基础饲料58.8%。

1.3 试剂及仪器

奥利司他片购自浙江海正药业股份有限公司。总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdesitylipoproteincholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(highdesitylipoproteincholesterol,HDL-C)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。RE-501型升降恒温水浴锅(上海予华仪器设备有限公司);CCA-20型低温冷却水循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司);InfiniteM200PRO型全波长酶标仪(瑞士Tecan公司);UV-1901双束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);5415D型冷冻低温离心机(德国Eppendorf公司);HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);XPcycler型PCR仪(杭州博日科技有限公司);Hiseq型高通量测序仪(美国Illumina公司)。

1.4 分组与给药

以85只SPF级SD大鼠为实验对象，随机分成空白组(10只)及诱导组(75只),空白组大鼠给予普通饲料，诱导组大鼠给予高脂饲料。喂养2周后淘汰25只肥胖抵抗大鼠，其余随机分为模型组(高脂饲料)、奥利司他组(高脂饲料+60mg/kg奥利司他)、地菍总黄酮高剂量组(高脂饲料+750mg/kg地菍总黄酮)、地菍总黄酮中剂量组(高脂饲料+500mg/kg地菍总黄酮)、地菍总黄酮低剂量组(高脂饲料+330mg/kg地菍总黄酮),连续给药6周，空白组及模型组给予相同容量的蒸馏水。

1.5 样本采集

给药6周后，随机采集空白组、模型组及地菍总黄酮高剂量组大鼠粪便(n=6),置于-80℃冰箱中保存，用于肠道菌群的检测；麻醉后称量各组大鼠体质量，测量体长后腹主动脉取血，血样样本离心收集血清，置于-80℃冰箱中冷冻保存，用于生化指标的检测；收集大鼠双肾周围及附睾周围白色脂肪，用于脂肪系数的测定。

1.6 指标测定

1.6.1 大鼠体质量及Lee’s指数

给药结束后将麻醉好的大鼠平摊仰卧，用卷尺精确测量鼻尖至肛门的长度，计算Lee’s指数，公式为Lee’s指数=m√3×103L(m为大鼠体质量，L为体长)。

1.6.2 脂肪系数

分离大鼠双肾及附睾周围的白色脂肪组织，称定质量后计算脂肪系数，公式为脂肪系数=(m1/m)×100%(m1为大鼠双肾及附睾周围白色脂肪组织质量，m为大鼠体质量)。

1.6.3 血清生化指标

包括TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，按照各试剂盒说明书操作进行测定。

1.6.4 粪便DNA提取和测序

采用SDS裂解液冻融法对空白组、模型组、地菍总黄酮高剂量组进行DNA提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，采用正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增。Barcode采用特定的7-bp特定序列合成到序列中，将PCR体系进行扩增、纯化、量化后，采用Hiseq高通量测序仪测序。

1.6.5 生物信息学分析

根据Barcode序列和引物序列从原始数据中拆分各个样本的数据，截去Barcode和引物序列后使用Vsearchv2.4.4软件对每个样品的reads进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，除去序列小于150bp、平均质量值低于20、含有不明确碱基的序列、含有>8bp的单核苷酸重复序列，得到最终有效序列(effectivetags)。OTU分析使用Vsearchv2.4.4软件分析，以97%相似度将序列聚类成操作分类单元(operationaltaxonomicunits,OUT),通过VSEARCH基于SILVA128数据库对代表序列进行物种注释，进行OUT水平Alpha多样性指数计算及不同组间菌群组成的相似性。

1.7 统计学分析

通过SPSS19.0软件进行处理，数据以(x¯±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 地菍总黄酮对高脂饮食大鼠体质量增重、Lee’s指数和脂肪系数的影响

由表1可知，与空白组比较，模型组大鼠体质量、Lee’s指数及双肾、附睾周围脂肪系数升高(P<0.01),说明模型建立成功；与模型组比较，奥利司他组和地菍总黄酮高、中、低剂量组大鼠体质量及双肾、附睾脂肪系数均降低(P<0.01);奥利司他组、地菍总黄酮高剂量组大鼠Lee’s指数降低(P<0.01)。

2.2 地菍总黄酮对大鼠血脂的影响

由表2可知，与空白组比较，模型组大鼠TC、TG水平升高(P<0.01),HDL-C水平降低(P<0.01),说明长期的高脂饮食诱导造成了大鼠血脂紊乱；与模型组比较，奥利司他组大鼠TC水平降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05);地菍总黄酮高剂量组大鼠TC、TG水平降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.01);地菍总黄酮中剂量组大鼠TG水平降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05)。

2.3 地菍总黄酮对大鼠肠道菌群的影响

2.3.1 平均有效序列、平均操作单元、平均覆盖度

由表3可知，空白组粪便菌群平均有效序列为132370条，经97%相似性归并后得到平均操作单元(OTUs)821个，平均测序覆盖深度(coverage指数)0.9989;模型组获得平均有效序列131568条，经97%相似性归并后得到平均OTUs为576个，平均测序覆盖指数为0.999;地菍总黄酮高剂量组粪便菌群获得平均有效序列127318条，经97%相似性归并后得到平均OTUs数707个，平均测序覆盖深度为0.9989。各组平均有效序列均高达12万条以上，说明样本满足测序要求；各组平均测序深度均在0.998以上，说明样品中序列未被测到的概率较低；空白组、模型组及地菍总黄酮高剂量组之间OTUs虽无差异，但与模型组比较，地菍总黄酮干预后有所增加，说明地菍总黄酮有提高高脂饮食大鼠菌群物种多样性的趋势。

2.3.2 OTU组成相似性

图1显示，空白组、模型组、地菍总黄酮高剂量组OTUs数目分别为1928、1527、1599,其中996个OTUs为3组所共有；3组均检出其特异的OTUs,分别为432、179、99;空白组与模型组共有的OTU数目为174,空白组与地菍总黄酮高剂量组共有的OTUs数目为326,表明地菍总黄酮提高了高脂饮食大鼠肠道菌群的多样性，同时也增加了高脂饮食大鼠与空白组OTU组成的相似性。

2.3.3 Alpha多样性

由表4可知，空白组、模型组、地菍总黄酮高剂量组Ace指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数均无明显差异(P>0.05);与模型组比较，地菍总黄酮高剂量组的Ace指数、Chao1指数及Shannon指数均有升高趋势，而且逐渐向空白组接近，提示地菍总黄酮有提高高脂饮食大鼠肠道菌群Alpha多样性的趋势。

2.3.4 地菍总黄酮对大鼠肠道菌群门水平的影响

由表5可知，与空白组比较，模型组厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度升高(P<0.05),拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度降低(P<0.01);与模型组比较，地菍总黄酮高剂量组拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度升高(P<0.01),厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度降低(P<0.01)。

2.3.5 地菍总黄酮对大鼠肠道菌群属水平的影响

由表6可知，与空白组比较，模型组摩根氏菌属(Morganella)、支原体菌属(Allobaculum)、柯林斯氏菌属相对丰度升高(P<0.05,P<0.01),考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、普雷沃茨菌属(Prevotella)、CF231菌属相对丰度降低(P<0.05);与模型组比较，地菍总黄酮高剂量组变形杆菌属(Proteus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、CF231菌属、普雷沃茨菌属(Prevotella)相对丰度升高(P<0.05,P<0.01),摩根氏菌属(Morganella)相对丰度降低(P<0.01)。

3、讨论

长期高脂饮食是引起肥胖、糖尿病、高血压、动脉硬化等疾病的重要危险因素之一[8,9]。体质量、Lee’s指数和脂肪系数是反映动物肥胖程度的重要指标。本研究发现地菍总黄酮能有效抑制高脂饮食诱导SD大鼠的体质量增加，降低Lee’s指数和脂肪系数，证实地菍总黄酮能有效抑制高脂饮食的转化与吸收，从而控制体质量增长。血脂紊乱是肥胖患者常见的代谢标志之一，血脂水平能够反映全身性的脂质代谢状态[10,11]。由于现代人们对高脂饮食的习惯，饮食中摄入大量胆固醇及脂肪，体内的游离脂肪酸增多，积聚的甘油三酯也逐渐增多，进而导致血脂异常。本实验发现地菍总黄酮能有效降低大鼠血清中TG和TC水平，提高HDL-C水平，LDL-C也有一定程度的改善作用，提示地菍总黄酮对高脂饮食大鼠具有降血脂的作用。

肠道菌群多样性是促进营养物质吸收、维持机体免疫和新陈代谢的基础，高脂饮食会导致肠道菌群多样性减少，膜完整性改变，导致通透性增加和脂多糖移位增加，免疫系统发生变化，产生炎症[12]。长期高脂饮食会降低肠道菌群的多样性，本实验初步探究地菍总黄酮对肠道菌群Alpha多样性及结构的影响，与空白组比较，模型组OTU数降低、肠道菌群Alpha多样性降低；与模型组比较，地菍总黄酮高剂量组OTU数升高、肠道菌群多样性升高。有研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门的水平和比例与宿主的身体质量指数(bodymassindex,BMI)有关[13]。Ley等[14]发现，肥胖人群厚壁菌门/拟杆菌门比值高于体质量正常人群，这与本研究结果相符，经过给予地菍总黄酮进行干预，高脂饮食大鼠拟杆菌门丰度升高，厚壁菌门丰度降低，厚壁菌门/拟杆菌门比值降低，且体质量降低。摩根氏菌属(Morganella)是一种条件致病菌，体内过多会使菌群比例失衡，发生泌尿感染等疾病[15]。

普雷沃茨菌属(Prevotella)能降解食物中的碳水化合物和多糖，并能参与合成多种维生素，有学者认为该菌种能产生对维持人体健康具有多种重要作用的短链脂肪酸(SCFA),抑制条件致病菌，保护宿主免受炎症和非感染性结肠疾病的侵害[16]。也有研究发现[17],高脂肪饮食所导致的超重或肥胖儿童体内普雷沃茨菌属的丰度降低。考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)能产生短链脂肪酸，对维持人体健康具有多种重要作用，如增强胃肠道机能、降低炎症水平等，据报道其相对水平与人类的积极乐观的情绪有关[18]。在本实验中发现，经过给予地菍总黄酮，增加了高脂饮食大鼠的肠道多样性，上调了拟杆菌门、考拉杆菌属及普雷沃茨菌属等潜在有益菌的相对丰度，下调厚壁菌门及摩根氏菌属等条件致病菌的相对丰度，这可能与地菍总黄酮影响肠道菌群，提高肠道菌群多样性，改善肠道菌群结构，抑制肠道内毒素进入血液诱发炎症反应，进而发挥降脂减重的作用机制有关。但由于体内肠道菌群是一个大整体，细菌菌群相互促进、相互制约的关系，具体机制有待进一步探究。

综上所述，本实验结果显示地菍总黄酮能降低高脂饮食大鼠体质量及增重，其作用机制可能与调节血脂紊乱有关；同时本研究采用高通量测序技术，初步探究了地菍总黄酮对高脂饮食大鼠肠道菌群的影响，推测其作用机制可能同降低厚壁菌门/拟杆菌门比值、降低条件致病菌、提高肠道菌群多样性、改善菌群结构有关。

参考文献:

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[3]翁竞玉,周敬凯,陈静梅,等.地薏黄酮对糖尿病小鼠糖脂代谢及氧化应激的影响[J].中国老年学杂志,2020,40(9):1950-1953.

[4]李丽,罗泽萍,周焕第,等.地蕊乙酸乙酯提取部位对糖尿病小鼠血糖､血脂及抗氧化作用的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(12)3250-3252.

[5]李丽,罗泽萍,周焕第,等.地薏正丁醇萃取物对链脲佐菌素致糖尿病模型小鼠的影响[J].医药导报,2014,33(2):173-176

[7]黄馨慧,赵璇,李丽,等.地薏中总黄酮的含量测定方法[J].医药前沿,2017,7(17):355-356.

[15]许阳阳,梁绍青.摩氏摩根菌中药的筛选及联合用药效果观察[J].农村实用技术,2018,(9):31-33.

文章来源：周敬凯,翁竞玉,朱盼,李丽.地菍总黄酮对高脂饮食大鼠减肥作用及肠道菌群的影响[J].中成药,2021,43(10):2673-2678.