肌腱病是骨科常见的疾病，全球每年新诊断的肌腱损伤患者有上万例。肌腱病主要由于肌腱长期过度使用导致肌腱的退行性改变所致，由于肌腱自身修复能力差，导致其损伤后恢复期长，甚至致残[1]。目前肌腱病的病因病理机制尚未定论，仍缺少有效的肌腱病治疗手段，在分子水平上研究肌腱病有助于开发新的治疗策略。目前国内外肌腱病研究主要集中在药物、物理治疗、富血小板血浆和肌腱干细胞等领域。有研究关注冲击波等物理干预手段对炎症因子白细胞介素6影响[2]，肌腱干细胞外泌体修复肌腱愈合[3]，滑膜多功能细胞对深层指屈肌腱修复[4]，阿司匹林通过调节JNK/STAT-3信号通路抑制损伤肌腱愈合中的炎症和瘢痕形成，氟喹诺酮类药物影响肌腱病[5,6,7]，局部类固醇注射、结核截骨治疗肌腱病变[8,9]，力学中应力变化与肌腱病的关系等方面[10]。

还有研究探讨了基质金属蛋白酶3和金属蛋白酶抑制剂2基因变异与慢性跟腱病易感性相关性[11]。国内研究集中在肌腱干细胞分化及炎症表达等领域，发现富血小板血浆和肌腱干细胞、脂肪干细胞分泌人特异性Ⅰ型胶原和肌腱蛋白C并分化为肌腱谱系，参与肌腱重塑[12]。不同载荷机械应力通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白敏感型复合体1和非经典Wnt5a信号轴调节肌腱干细胞的成骨分化以及炎症因子在肌腱病中的作用[13,14]。早期肌腱病组织中M1及M2的下游靶点干扰素、核因子κB和STAT-6被激活，而晚期上调M2激活的下游靶点STAT-6[15]。还有研究关注中药对肌腱病的作用，如续断汤剂可上调转化生长因子β1信号通路表达，促进跟腱愈合，但未能深入挖掘相关受体、靶基因以及两者相互之间的作用规律。

川续断属川续断科(Dipsacaceae)植物川续断(Dipsacus)的根，其化学成分主要为生物碱类、挥发油类、皂苷类、环烯醚萜糖苷类和多糖类。中医认为川续断具有补益作用，是一种有效的镇痛抗炎药物，常用于治疗腰痛、风湿性关节炎、创伤性血肿、习惯性流产、骨折等。川续断皂苷VI是川续断中一种极具药用价值的三菇皂苷类化合物，既往研究显示其具有神经保护、心肌保护、抗骨质疏松、保肝降脂等生物学作用[16]，其中抗骨质疏松作用明显[17,18,19]。川续断皂苷VI可依赖于骨形态发生蛋白2/Smad、RUNX2、MAPK及PI3K/Akt等信号轴保护骨组织[20]。近年来研究认为肌腱病修复过程与肌腱细胞增殖、肌腱干细胞分化机制紧密相关[13,21]。同时有研究表明川续断皂苷VI可通过调控转化生长因子β1/Smad、Bax、Caspase-3、缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白[22]、碱性磷酸酶、OCN、RUNX等影响细胞增殖凋亡、抗炎和肌腱干细胞异常分化促机体软组织修复，而以上因子均可能参与肌腱病的发生发展。为探索川续断皂苷VI对肌腱病的作用，实验建立兔肌腱病模型进行分析。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验。

1.2 时间及地点

实验于2019年12月至2020年6月在运动医学四川省重点实验室/国家体育总局运动医学重点实验室动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物

成年新西兰纯种雄性大白兔48只，体质量(2.04±0.16)kg，于SPF级运动医学四川省重点实验室动物房饲养，1只/笼，提供国家标准级啮齿动物饲料，均由达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2013-24。动物房保持通风干燥，相对湿度为55%-70%，室温20-25℃。动物实验于2019-11-04经成都体育学院动物伦理委员会批准，批准号：成体伦理[2020]21号。

1.3.2 实验使用的主要试剂

川续断皂苷VI(美国化学文摘CAS编号：39524-08-8)，购自上海源叶生物科技有限公司，高效液相色谱检测纯度≥98%，批号：Z18M10L83256。前列腺素E2购自罗恩公司。

1×转移缓冲液：甘氨酸43.2g,Tris9.09g，甲醇600mL，蒸馏水定容至3L;1×电泳缓冲液：甘氨酸86.4g,Tris18g,10%SDS30mL，用蒸馏水定容至3L;1×PBS缓冲液：NaCl24g,KCl0.6g,Na2HPO410.74g,KH2PO40.81g，用蒸馏水定容至3L;1×PBST缓冲液：1L1×PBS加入500μL吐温20;RIPA缓冲液：50mmol/LTris-HCl(pH7.4),150mmol/LNaCl,1%NP-40,0.1%SDS;2×SDS上样缓冲液：1mol/LTrisHCl(pH6.8),SDS0.2g，溴酚蓝0.01g，甘油1mL，用蒸馏水定容至5mL，加入β-巯基乙醇0.1mL后小剂量分装。DAB试剂盒、辣根酶系列二抗购自北京中杉金桥；BCA试剂盒购自碧云天；脱脂奶粉购自皖达山；发光底物购自PIERCE；基质金属蛋白酶1抗体、金属蛋白酶抑制剂1抗体购自武汉三鹰；转化生长因子β1抗体购自Abcam；纤溶酶原激活物抑制剂1抗体购自Genetex；山羊抗兔抗体、山羊抗鼠抗体购自中杉金桥公司；显影液、定影液购自乐凯；小动物手术操作台购自博睿达。

1.3.3 实验使用的主要仪器

超低温高速离心机购自Thermo；普通离心机购自MicroCentaur；电泳电源购自CIB-RAD；转膜仪购自北京市六一仪器厂；恒温培养箱购自上海医疗仪器械厂；聚偏二氟乙烯膜购自Millipore；酶标仪购自北京普朗；光学显微镜购自宁波舜宇仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物建模及分组

48只兔正常喂养1周后，采用数字随机法分为正常组(n=8)、模型组(n=32)和生理盐水组(n=8)[23]。

模型组参照KHAN等[24]方法对左侧跟腱造模。兔俯卧位固定在小动物手术操作台上，在兔左跟骨附着点近端约距离2.0cm处注射300ng前列腺素E2,1次/周，共4次。生理盐水组在左跟骨附着点近端约距离2.0cm处注射0.2mL生理盐水，1次/周，共4次。连续4周注射前列腺素E2后，随机取10只行肌骨超声检测(S2000，西门子公司)，观察回声强弱、血流信号和跟腱粗细，确认动物造模是否成功。

1.4.2 干预治疗

将造模成功的32只兔，再次通过数字分组法随机分为川续断皂苷VI低剂量组、川续断皂苷VI中剂量组、川续断皂苷VI高剂量组和模型组，每组8只。川续断皂苷VI低、中、高剂量组分别腹腔注射10,20,40mg/kg川续断皂苷VI,1次/d，连续4周，药物均以生理盐水溶解。生理盐水组和模型组注射等量医用生理盐水。在末次给药后24h禁食且不禁水，称量体质量后用空气栓塞法处死。

1.4.3 肌腱相关蛋白检测

将肌腱组织研磨碎后，以BCA试剂盒测定总蛋白，采用Westernblot法检测组织中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶抑制剂1、转化生长因子β1、纤溶酶原激活物抑制剂1的表达。使用兔抗金属蛋白酶基质金属蛋白酶1(1∶500)、兔抗金属蛋白酶抑制剂1(1∶500)、鼠抗转化生长因子β1(1∶300)、兔抗纤溶酶原激活物抑制剂1(1∶300)37℃孵育2h，而后使用山羊抗兔抗体或山羊抗鼠抗体37℃孵育1h。结果以与β-actin的吸光度比值表示。

1.4.4 肌腱组织病理学检测

收集左下肢跟腱组织，甲醛固定，石蜡包埋，纵向切片4-6μm，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肌腱纤维形态、细胞核、血管增生和炎细胞浸润等现象。

参照陈磊[25]的半定量评分标准光镜下观察染色后纤维组织排列结构、细胞核形态密度、炎性细胞浸润程度及新生血管增生等参数变化情况，评分标准见表1。每个项目中0为正常，3为损伤严重。

1.5 主要观察指标

组织病理变化以及肌腱组织中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶抑制剂1、转化生长因子β1、纤溶酶原激活物抑制剂1的表达情况。

1.6 统计学分析

统计学分析应用SPSS17.0统计软件(美国SPSS公司)和GraphPadPrism8.0.1.244x64(美国GraphPad公司)。计量资料以表示，组间多重比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

各组实验动物均顺利完成实验周期，未出现体质量异常、跟腱红肿及流脓等情况或其他疾病表现。

2.2 川续断皂苷VI对肌腱病模型兔肌骨超声表征的影响

正常组肌腱回声均匀连续，边界清晰，未见异常血流信号。模型组可见肌腱明显增粗，回声异常，跟骨上2cm局部可见多处不均匀回声团，边界不清，周围筋膜回声团信号增强，血流较为丰富。生理盐水组回声基本均匀，未见异常血流信号。川续断皂苷VI低剂量组回声团强度不等，周围筋膜回声增强，血流信号仍较丰富，肌腱较明显增粗，炎性反应较强；川续断皂苷VI中、高剂量组可见回声强度较均匀，肌腱增粗不明显，边界较清晰，且两组超声表现接近，见图1。

2.3 川续断皂苷VI对肌腱病模型兔肌腱细胞中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶抑制剂1、转化生长因子β1及纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响

与正常组相比，模型组基质金属蛋白酶1表达水平较高；而与模型组相比，川续断皂苷VI中、高剂量组基质金属蛋白酶1表达下调(P<0.05)。模型组金属蛋白酶抑制剂1水平高于正常组，而在川续断皂苷VI低、中、高剂量组均可降低金属蛋白酶抑制剂1的表达水平(P<0.05)。与模型组相比，川续断皂苷VI低、中、高剂量转化生长因子β1表达水平上调(P<0.05)。与模型组相比，川续断皂苷VI高剂量纤溶酶原激活物抑制剂1表达水平升高(P<0.05)，见图2。

2.4 川续断皂苷VI对肌腱病模型兔肌腱病理变化的影响

模型组肌腱纤维紊乱，排列呈明显波浪形改变，结构不完整，出现新生血管异常增生，炎性细胞浸润，细胞核明显变圆，细胞密度增加明显等现象。川续断皂苷VI低剂量组仍可见较为纤维结构明显松散、些许断裂，部分纤维呈波浪形排列，细胞核仍有变圆趋势，细胞密度增加；川续断皂苷VI中剂量组可见纤维组织有少许断裂及轻微波浪形表现；而川续断皂苷VI高剂量组肌腱纤维组织排列较有序完整，无明显波浪形表现，细胞密度亦无异常，见图3。

与模型组相比，川续断皂苷VI低、中、高剂量组肌腱修复评估得分依次递减(P<0.05)，见图4。

3、讨论

基质金属蛋白酶可导致细胞外基质的降解，也诱导细胞内钙的释放，导致细胞凋亡[26]。基质金属蛋白酶1具有调控肌腱组织的胶原代谢与细胞外基质重塑、分解基质Ⅰ型胶原、分解变性或者坏死肌腱组织的作用。金属蛋白酶抑制剂1是基质金属蛋白1的拮抗剂，与基质金属蛋白酶1含量成正比，常作为基质金属蛋白酶1的配对指标共同测定。病理状态下基质金属蛋白酶1含量剧烈升高，程度大于金属蛋白酶抑制剂1，可能导致基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶抑制剂1比值增大，使得基质中胶原纤维处于代谢失衡净降解状态，进而出现肌腱断裂或产生肌腱病[27]。

此次实验结果显示，川续断皂苷VI治疗后兔变性或坏死的肌腱组织已经大量减少，且40mg/kg川续断皂苷VI作用后基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1含量最接近正常水平。有研究表明川续断皂苷VI可减少活性氧的产生，通过调控Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达，抑制线粒体膜电位的损伤和内皮细胞凋亡[28,29]。作者认为川续断皂苷VI在动物体内能够减少细胞凋亡，并通过恢复基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶抑制剂1比例，加快受损肌腱的恢复与胞外基质重塑。注射生理盐水对正常肌腱组织不造成影响，同时也进一步证明了川续断皂苷VI治疗的有效性。

有研究表明川续断皂苷VI剂量依赖性治疗促进了细胞增殖、迁移和增强体外血管生成能力，与上调缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子信号有关[30]。川续断皂苷VI通过PI3K/AKT信号轴促去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨因子的表达增强，并激活细胞增殖[31]，亦可通过激活p38和ERK1/2靶点诱导促成骨细胞成熟和分化，促进骨和腱骨结合处纤维软骨的生成，加快腱骨愈合[32]。有研究报道续断在促进Sharpey样胶原纤维生成、腱骨处成纤维细胞增殖等方面具有重要意义，且与浓度剂量成一定正相关性[33]。川续断水提物通过抑制核因子κB和ERK1/2和激活巨噬细胞Nrf2/血红素氧合酶1，降低促炎细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β和活性氧水平，从而发挥抗炎和抗氧化的作用[34]。转化生长因子β1是肌腱病修复有效的效应指标，其表达上调可促进肌腱愈合重塑和提升力量[35,36,37]。韧带、软骨、肌腱等软组织受损修复过程均有α肌动蛋白参与，在人肩袖肌腱细胞中转化生长因子β生成α肌动蛋白促肌腱修复[38]。转化生长因子β1还可促进肌腱细胞DNA合成，增加胶原表达，促进肌腱愈合[39]。

转化生长因子β1能通过促进细胞增殖而间接促胶原合成。有研究发现转化生长因子β1通过Ⅰ型受体激活Ras/ERK促进胶原mRNA表达[40]。另有文献提出转化生长因子β1也能协同血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等促进成纤维细胞分解参与肌腱的修复和愈合[41]。转化生长因子β1与胰岛素样生长因子1和增殖细胞核抗原协同高表达促进胶原合成、肌腱细胞增殖以及肌腱再生[21]。目前大量研究发现转化生长因子β1在肌腱修复中高表达节点可能与动物种类、何种修复方法有关[42]。川续断皂苷VI生物学作用主要为促细胞增殖、抗炎，其在肌腱损伤后组织修复和瘢痕形成开始启动。实验显示川续断皂苷VI可能通过转化生长因子β1途径促进胞外基质胶原增殖重塑、肌腱细胞增殖与局部抗炎多层效果累积，因此可见其对肌腱病的治疗是值得进一步探究的。也有研究发现转化生长因子β1在幼羊肌腱修复中未能高表达[43]。虽抑制转化生长因子β1蛋白表达可减少肌腱粘连和组织瘢痕形成[44]，但不一定能提高肌腱的机械力学性能。亦有转化生长因子β1直接抑制蛋白多糖表达会使肌腱细胞外基质紊乱等观点[45]。

有研究显示人表皮成纤维细胞以及表皮角化细胞株A-5中转化生长因子β可抑制基质金属蛋白酶1表达[46]。人腹膜间皮细胞中转化生长因子β对金属蛋白酶抑制剂1mRNA表达起上调作用[47]。转化生长因子β还可通过激活Smad通路、MAPK通路及刺激AP-1转录因子生成等不同下游靶点调节基质金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制剂基因的表达。外源性转化生长因子β也会抑制基质金属蛋白酶1与金属蛋白酶抑制剂1复合物水平[48]。转化生长因子β1升高抑制基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶抑制剂1复合物表达，促进肌腱修复。FARHAT等[49]认为转化生长因子β1在肌腱修复中具有促胶原表达和/或破坏细胞外基质平衡致纤维化的多重生物学效应，由此转化生长因子β1既参与肌腱粘连和组织瘢痕形成，又可促进肌腱愈合，具有双向调节作用，参与肌腱修复过程复杂，在肌腱修复中的作用还需进一步明确探究。

川续断皂苷VI干预可使纤溶酶原激活物抑制剂1蛋白表达呈剂量依赖性升高。FARHAT等[50]研究发现转化生长因子β1能直接抑制基质金属蛋白酶2和纤溶酶生成的纤溶酶原激活物抑制剂1，且表现出剂量依赖性升高。转化生长因子β1可诱导其信号通路下游的特异性靶基因纤溶酶原激活物抑制剂1表达增加，后者是尿激酶纤维蛋白溶酶原激活系统的主要抑制剂，可通过干扰细胞的黏附及促进基底膜降解而引起细胞的移行和浸润[51]。在瘢痕疙瘩成纤维细胞中纤溶酶原激活物抑制剂1高表达可减少纤维蛋白降解，使细胞外基质成分胶原出现大量沉积，从而引发纤维化及瘢痕形成[52]。肌腱细胞外基质中成分的异常是导致纤维化的最主要因素，而延缓或阻止纤维化的发生和进展可明显改善肌腱损伤[53]，可能为肌腱重塑提出潜在治疗靶点。

此次实验发现，跟腱病兔模型经40mg/kg川续断皂苷VI干预后，可最大限度平衡基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶抑制剂1比例，促进转化生长因子β1和纤溶酶原激活物抑制剂1表达，且其纤维组织排列形态均接近正常肌腱组织。基于此，认为川续断皂苷VI对肌腱病中受损肌腱的修复与保护主要是通过恢复细胞外基质胶原代谢、诱导肌腱细胞增殖，抑制细胞外基质过度降解及胶原代谢异常，平衡细胞外基质物质破坏与产生，抑制其病变进程，利于保持跟腱胶原的稳定性，以恢复肌腱纤维的机械强度及生物力学性能[54]，缓解肌腱病症状，但也提示肌腱修复中有细胞外基质沉积及纤维化过程发生。因此作者推测川续断皂苷VI很可能成为防治腱病的理想药物，但其防治机制仍需进一步研究。

参考文献:

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文章来源：王坤,何本祥.川续断皂苷Ⅵ修复兔肌腱病[J].中国组织工程研究,2022,26(02):211-217.