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决明子提取物对高脂血症大鼠血脂和肝肾功能的影响

2021-12-03 258 上传者：管理员

摘要：目的研究决明子提取物对高脂血症大鼠血脂和肝肾功能的影响。方法制备决明子总提取物(JMZ-Total),采用溶剂萃取法分别制备决明子乙酸乙酯萃取部分(JMZ-EA)和决明子剩余部分提取物(JMZ-Residue),并建立指纹图谱。建立SD大鼠高脂血症模型,根据总胆固醇(TC)水平随机分为5组,每组10只;模型对照组给予蒸馏水,阳性对照组给予阿托伐他汀钙,剂量为10mg/kg体重,其他3组分别给予JMZ-Total、JMZ-EA和JMZ-Residue,剂量均为10g/kg体重。各组大鼠按1mL/100g体重连续灌胃4周后,检测血清TC、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)。结果指纹图谱显示JMZ-EA和JMZ-Residue在285nm处不同保留时间的色谱峰差别较大,目标成分橙黄决明素主要分布在JMZ-EA。给药后,JMZ-EA组血清TG和LDL-C水平低于模型对照组,AST、TBIL和DBIL水平高于模型对照组(均P<0.05);JMZ-Redidue组血清TG水平低于模型对照组,AST水平高于模型对照组(均P<0.05)。结论JMZ-EA和JMZ-Residue主要组成成分不同,前者有更好的辅助降血脂作用,但对大鼠胆红素代谢有一定影响。

关键词：
决明子
肝功能
肾功能
血脂
高脂血症
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决明子为豆科植物决明（CassiaobtusifoliaL.）或小决明（CassiatoraL.）的成熟种子，始载于《神农本草经》，具有清热明目、润肠通便的功效[1]，作为药品和保健食品原料被大量使用[2]。决明子的主要化学成分包括蒽醌类、萘并吡喃酮类、脂肪酸类、糖类和氨基酸等。现代药理学研究发现，决明子可降低血脂、血压，但毒理研究发现它有引起肝肾损伤和胃肠道损伤的潜在风险[3,4,5,6]。目前关于决明子的研究多为药理或毒理作用的独立性研究，其有效成分和毒性成分仍不清楚，缺少功效、毒性和化学成分三者之间相互关系的研究。本研究采用溶剂萃取法对决明子总提取物（JMZ-Total）进行化学成分分离，分别制备决明子乙酸乙酯萃取部分（JMZ-EA）和决明子剩余部分提取物（JMZ-Residue）进行平行对比，观察其对高脂血症大鼠血脂及肝肾功能的影响。

1、材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1260infinityII超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），7180型全自动生化检测仪（日本HITACHI公司），R-300旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），AL-204电子分析天平（瑞士MET-TLER-TOLEDO公司），R540IE动物麻醉系统（中国瑞沃德公司），5810R台式高温低速离心机（德国Eppendorf公司），ALPHA冷冻干燥仪（德国Christ公司）。决明子药材（批号200515，杭州华东中药饮片有限公司），为豆科植物决明和小决明的干燥成熟种子。橙黄决明素（批号200180-180803，江苏永健医药科技有限公司）。阿托伐他汀钙片（批号OB0024DL4，齐鲁制药有限公司），临用前用超纯水配置成1mg/mL溶液用于灌胃。高脂饲料（北京科澳协力饲料有限公司）。试剂：乙醇、乙酸乙酯（分析纯，杭州双林化工试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Sigma公司）；Milli-Q超纯水（Millipore公司）。

1.2 实验动物

实验用SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2017-0005。大鼠饲养在SPF级环境中，温度22～25℃，相对湿度50%～70%，单笼饲养，自由取食、饮水，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2018-0018。实验中涉及动物操作程序己通过浙江省疾病预防控制中心动物使用与管理委员会审查。

1.3 方法

1.3.1 决明子提取物制备

取决明子适量，敲碎后置于圆底烧瓶中，第1煎加入5倍量90%乙醇浸没，90℃回流提取60min，待冷却后用300目筛网过滤煎煮液；第2煎加入5倍量90%乙醇浸没，90℃回流提取60min,300目筛网过滤后合并2次煎出液，于50℃减压浓缩，经冷冻干燥得到JMZ-Total。取JMZ-Total加适量水溶解后，加等体积乙酸乙酯萃取4次，合并上层萃取液，于50℃减压浓缩，经冷冻干燥得JMZ-EA。下层剩余部分减压浓缩，经冷冻干燥得JMZ-Residue。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：WatersBEHC18(1.7μm,2.1mm×100mm）。流动相A：乙腈；流动相B:0.01%甲酸水溶液。检测波长：285nm。梯度洗脱：0～4min,5%A;4～6min,5%～15%A;6～20min,15%～20%A;20～25min,20%～30%A;25～29min,30%～40%A;29～32min,40%～50%A;32～36min,50%～80%A;36～40min,80%～100%A。流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：1μL。

1.3.3 对照品溶液制备

称取橙黄决明素1mg于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，制成橙黄决明素单标储存液。量取单标储存液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶液（体积比为1∶1）定容至刻度，配制成每1mL含橙黄决明素1μg的对照品溶液。

1.3.4 供试品溶液制备

分别称取制备的JMZ-Total、JMZ-EA和JMZ-Residue粉末适量于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，制成不同提取物溶解液。分别量取上述溶解液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶液（体积比为1∶1）定容至刻度，14000×g离心5min，取上清液作为供试品溶液。

1.3.5 模型制备

取健康雄性SD大鼠60只，适应性饲养1周后，按体重分层随机分为2组。空白对照组10只给予维持饲料，造模组50只给予高脂饲料，连续喂养2周后眼眶静脉丛取血（不禁食）。分离血清并采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。若造模组TC、TG和LDL-C较空白对照组显著升高，即为造模成功。选取造模成功的大鼠进行后续实验。

1.3.6 实验方法

造模组大鼠根据TC水平随机分为3个给药组、1个模型对照组和1个阳性对照组，每组10只。给药组分别给予JMZ-Total、JMZ-EA和JMZ-Residue，剂量均为10g/kg体重；阳性对照组给予阿托伐他汀钙，剂量为10mg/kg体重；模型对照组给予蒸馏水。各组大鼠按1mL/100g体重每日灌胃，高脂饲料喂养。给药期间每日观察各组大鼠体征、行为活动、毛发、大小便颜色和有无异常分泌物等。4周后异氟烷吸入麻醉，腹主动脉取血（禁食），采用全自动生化检测仪测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和间接胆红素（IBIL）。

1.4 统计分析

采用SPSS11.5软件统计分析。定量资料服从正态分布，采用均数±标准差描述，给药前6组大鼠的血脂水平组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey法。给药试验结束后，以给药前生化值为协变量，对除空白对照组外的5组大鼠生化指标组间比较采用单因素协方差分析，进一步与模型对照组两两比较采用Bonferroni法。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 决明子提取物的指纹图谱

对照品和供试品溶液分析结果显示，在橙黄决明素最大吸收波长285nm处，JMZ-EA和JMZ-Residue不同保留时间的色谱峰差别较大，即JMZ-EA和JMZ-Residue化学成分有显著差异，目标成分橙黄决明素主要分布在JMZ-EA。见图1。

2.2 高脂血症大鼠模型建立

采用高脂饲料喂养2周后，6组大鼠HDL-C水平差异无统计学意义（F=0.447,P=0.813);TC、TG和LDL-C水平差异有统计学意义（F=14.068、7.568、6.599，均P<0.001）。进一步两两比较结果显示，造模组大鼠TC、TG和LDL-C水平均高于空白对照组（P<0.001），造模组大鼠间TC、TG和LDL-C水平均差异均无统计学意义（P>0.05）。提示给药前造模组大鼠血脂水平较为一致，造模成功。见图2。

2.3 大鼠一般情况

空白对照组、模型对照组、阳性对照组和给药组大鼠给药前后一般状态观察结果正常。给药期间，JMZ-Total组和JMZ-EA组大鼠均出现尿液颜色变黄，给药组大鼠均出现大便颜色变深。未发生因给予决明子而引起的大鼠濒死和死亡的毒性反应。

2.4 高脂血症大鼠血脂指标比较

给药前各组大鼠TC、TG、HDL-C和LDL-C水平差异均无统计学意义（P>0.05）。给药后各组大鼠试验末TC、TG和LDL-C水平差异均有统计学意义（P<0.05);HDL-C水平差异无统计学意义（P>0.05）。阳性对照组、JMZ-Total组和JMZ-EA组TG和LDL-C水平均低于模型对照组（P<0.001);JMZ-Residue组TG水平低于模型对照组（P<0.001）。见表1。

2.5 高脂血症大鼠肾功能指标比较

给药前后各组大鼠Cr和BUN水平差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.6 高脂血症大鼠肝功能指标比较

给药前各组大鼠ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和IBIL水平差异均无统计学意义（P>0.05）。给药后各组大鼠AST、TBIL、DBIL和IBIL水平差异均有统计学意义（P<0.05),ALT和ALP水平差异均无统计学意义（P>0.05）。JMZ-Total组和JMZ-EA组AST、TBIL、DBIL和IBIL水平均高于模型对照组（P<0.001);JMZ-Residue组AST水平高于模型对照组（P<0.001）。见表3。

3、讨论

本研究采用高脂饲料法建立高脂血症大鼠模型，造模组大鼠TC、TG和LDL-C水平均显著高于空白对照组，提示造模成功。该造模方式简单易行，贴近临床，为降血脂药物的研究和开发提供较好基础。决明子在我国被列为药食两用品种，临床广泛应用于降血脂和预防高脂血症，但其药效-毒性的双重性[6,7]制约了在临床用药和保健食品方面的应用，因此研究决明子提取物在降血脂作用基础上对肝肾功能的影响具有重要意义。

张荣等[8]和张加雄等[9]通过系统溶剂法对决明子进行分部位提取，发现乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物为降血脂有效部分，提示决明子提取物的提取部分不同可导致药效差异[10]。有研究报道决明子有肝保护作用[11,12]，但另有研究发现决明子可导致肝损伤[13,14]，造成差异的原因可能是决明子的提取方式不同。此外，研究发现决明子中蒽醌类成分橙黄决明素有降血脂作用和肝损伤风险[10,15]。因此，本研究采用乙醇提取加乙酸乙酯萃取的方法，以橙黄决明素为目标成分进行组分分离，对不同萃取组分进行平行对比。血清TC、TG、HDL-C和LDL-C是衡量高脂血症的重要指标，ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL是反映肝功能的生化指标。本研究发现，JMZ-EA和JMZ-Residue均能显著降低血清TG水平，起到调节血脂作用，其中JMZ-EA还能同时降低LDL-C水平。

JMZ-EA与JMZ-Total导致血清AST、TBIL和DBIL升高程度相当，JMZ-Residue仅导致AST显著升高，TBIL和DBIL水平没有明显差异。胆红素是血红蛋白的分解代谢产物，主要通过肝脏摄取代谢后经胆汁排泄，因此血清中TBIL和DBIL水平是反映肝胆摄取排泄功能的主要指标[16]。LDL-C升高会导致患动脉粥样硬化的风险增加，降低血清LDL-C水平对心血管有保护作用[17]。综上所述，本研究表明在大鼠高脂模型中，相较于JMZ-Residue,JMZ-EA有更好的降血脂作用，但可能影响胆红素代谢，具体的作用过程和机制有待进一步探讨。

参考文献:

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文章来源：朱周靓,张世鑫,郑云燕,严峻,孟真,胡争艳.决明子提取物对高脂血症大鼠血脂和肝肾功能的影响[J].预防医学,2021,33(12):1290-1294.