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栀子活性物质石油醚层组分快速抗抑郁作用及机制

2023-08-10 169 上传者：管理员

摘要：本研究旨在研究栀子的石油醚层组分的快速抗抑郁作用及其机制。通过行为测试和蛋白质印迹分析，我们发现栀子石油醚层组分具有显著的抗抑郁效果，并且可以增加海马中BDNF和TrkB的表达。悬尾试验和强迫游泳试验结果显示，栀子石油醚层组分可显著减少不动时间，表明其具有抗抑郁活性。蔗糖偏爱试验结果显示，栀子石油醚层组分可增加小鼠对蔗糖的偏好。研究结果表明，栀子石油醚层组分的抗抑郁作用可能与BDNF-TrkB信号转导途径的调节有关。这些发现为进一步研究栀子石油醚层组分的抗抑郁机制和开发相关药物提供了重要线索。

关键词：
BDNF-TrkB信号传导途径
快速抗抑郁作用
栀子(Gardenia jasminoides Ellis)
栀子石油醚层
茜草科
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栀子(Gardenia jasminoides Ellis)属于茜草科(Rubiaceae)栀子属植物，是中国著名的传统中药方剂越鞠丸的五大中草药之一。越鞠丸在800年前被用于治疗与心境障碍相关的症状。越鞠丸在单次给药后显示出快速的抗抑郁潜力，类似于氯胺酮，并且临床研究证据支持其在快速起效的抗抑郁药效中的作用。栀子或越鞠丸的快速抗抑郁机制类似于氯胺酮，即在海马中急性上调脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达(Duman and Aghajanian,2014)。BDNF是神经营养因子家族的成员，它支持神经元在发育过程中的存活，并促进成年大脑的连通性和可塑性(Lindholm and Castrén,2014)。BDNF的高亲和性受体Tropomyosin receptor kinase B (TrkB)与其结合后，触发海马中各种细胞内信号通路，有利于抑郁症的治疗(Duman et al.,2012)。因此，可以预见栀子中具有快速抗抑郁作用的活性成分可能通过上调BDNF和TrkB的表达来发挥作用(Autry et al.,2011)。鉴定具有快速抗抑郁作用的栀子组分是发现新型快速抗抑郁化合物并阐明潜在机制的重要一步。

本研究的目标是鉴定栀子中具有快速抗抑郁效应的活性成分，并研究它们与海马中BDNF-TrkB信号转导的关联。首先进行了栀子的化学提取和标准化，得到了四个组分，并对其进行筛选，以评估其作为快速抗抑郁药物的潜力。随后，利用慢性轻度应激(chronic mild stress,CMS)模型验证了鉴定的组分的快速抗抑郁效应。在这个模型中，抗抑郁作用需要慢性重复给药的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)，但仅需单次给药的氯胺酮即可产生抗抑郁作用。在对给予单剂假定有效组分的CMS小鼠进行综合测试后，评估了抑郁样和焦虑样行为。最后，本研究评估了单次剂量的快速抗抑郁组分对海马中BDNF和TrkB表达的影响。

1、结果与分析

1.1栀子石油醚层显示出快速的抗抑郁药样潜力

根据溶剂极性顺序分离出栀子乙醇提取物的四个组分。采用悬尾试验和强迫游泳试验对所得的溶剂萃取组分进行快速抗抑郁活性筛选，在单次给药后的24 h进行评估，这个时间点在越鞠丸或栀子乙醇提取物以及氯胺酮显示出快速抗抑郁效果。在悬尾试验中，仅栀子石油醚层处理显示出显著缩短不动时间的效果(P<0.05)，与氯胺酮类似。在强迫游泳试验中，栀子石油醚层和正丁醇层处理的小鼠均显示出显著缩短不动时间的效果(P<0.01)(图1)。

1.2蔗糖偏爱试验

蔗糖偏爱试验是一种衡量快感缺失的方法，也是抑郁症的核心症状之一。在栀子石油醚层组分单次给药后的2 d，与对照组相比，CMS小鼠的蔗糖偏好明显减少(P<0.01)。与赋形剂组相比，单独处理栀子石油醚层组分显著增加了蔗糖偏好(P<0.01)(图2)。

图1栀子乙醇提取物的四个组分对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响

1.3尾部悬吊和强迫游泳试验

在尾部悬吊试验(tail suspension test,TST)中(P<0.01)或强迫游泳试验(forced swimming test,FST)中(P<0.01),CMS赋形剂组的不动时间显著延长，与非CMS对照组相比(P<0.01)。与赋形剂相比，急性处理栀子石油醚层组分可显著缩短TST中的不动时间(P<0.01)，与氯胺酮的效果相似(P<0.01)。栀子石油醚层组分在FST中也观察到显著的抗抑郁作用(P<0.01)(图3)。

1.4开场试验

在开场试验中，CMS对小鼠的自发行走总距离和焦虑样反应的测量没有产生影响，表明CMS程序未改变开场行为(图3)。栀子石油醚层组分对小鼠在开场试验中的自发行走总距离也没有影响(P>0.05)(图4)。

图2栀子乙醇提取物石油醚层组分对小鼠蔗糖偏爱的影响

图3栀子乙醇提取物石油醚层对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响

1.5栀子石油醚层可增加BDNF和TrkB的表达

根据研究发现，急性给药栀子的乙醇提取物可以增加BDNF的表达，从给药后3 h开始，并在一次给药后持续20 h以上(Zhang et al.,2015;Ren et al.,2016)。在给药后3 h，与对照组相比，栀子石油醚层处理后显示海马区域中BDNF和TrkB的表达显著增加，类似于氯胺酮(图5)。类似的效果在给药后24 h也被观察到(图6)。

图4栀子石油醚层组分对小鼠行走总距离的影响

图5给药3 h后小鼠海马区BDNF和TrkB的表达水平

2、讨论

本研究通过对栀子的石油醚层组分进行研究，发现其具有快速的抗抑郁作用。在行为测试中，栀子石油醚层组分在悬尾试验和强迫游泳试验中显著缩短了不动时间，表明其具有抗抑郁效果。此外，在蔗糖偏爱试验中，栀子石油醚层组分也显著增加了小鼠对蔗糖的偏好，表明其可能改善了快感缺失症状。

图6给药24 h后小鼠海马区BDNF和TrkB的表达水平

进一步的分析表明，栀子石油醚层组分的抗抑郁作用可能与BDNF-TrkB信号转导途径的调节有关。实验结果显示，栀子石油醚层组分的单次给药显著增加了海马区中BDNF和TrkB的表达。BDNF在神经元存活、突触可塑性和突触传递中发挥重要作用，而TrkB是BDNF的受体。栀子石油醚层组分可能通过上调BDNF和TrkB的表达来发挥其抗抑郁效应。

与氯胺酮相比，栀子石油醚层组分在悬尾试验和强迫游泳试验中表现出类似的抗抑郁效果。这表明栀子石油醚层可能具有与氯胺酮类似的作用机制，可能通过调节BDNF-TrkB信号转导途径来发挥抗抑郁作用(Blendy,2006;Xue et al.,2016)。

值得注意的是，本研究还发现栀子石油醚层组分对开场行为没有显著影响，表明其作用主要集中在抑郁样行为上。此外，栀子石油醚层组分的抗抑郁效应可能涉及其他细胞信号和蛋白质的生化处理，如5-HT受体和PKA-CREB细胞内途径。

综上所述，本研究的结果表明栀子石油醚层组分具有快速的抗抑郁效应，并且其作用可能通过调节BDNF-TrkB信号转导途径发挥作用。这为寻找栀子石油醚层组分中负责其抗抑郁效应的单个化合物以及进一步研究其机制提供了理论基础。进一步的研究可以阐明栀子石油醚层组分的药理作用和临床应用的潜力。

3、材料与方法

3.1实验动物

本研究使用7～9周龄(16～25 g)的雄性昆明小鼠作为实验对象。在行为测试之前，小鼠在动物设施中习惯环境中逗留1周。小鼠被保持在12 h光照和12 h黑暗的循环中，并提供自由进食和饮水的机会。所有的动物实验程序均得到南京中医药大学机构动物保护和使用委员会的批准，并符合《实验动物管理和使用指南》的要求。实验者在老鼠分配方面持中立立场。

3.2栀子有效成分提取

栀子(果实)采集于10月份，来自浙江地区，以确保植物的最大干重。采集的栀子样本已保存在研究所植物标本馆作为凭证标本。栀子经过旋风磨研磨成粉末，并通过60目的筛网进行筛选。将500 g栀子在室温条件下用95%乙醇进行3次浸泡，得到栀子乙醇提取物。提取物在低于55℃的减压条件下进行过滤和干燥，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水进行提取。得到的提取物质量分别为：石油醚层(34.8 g)、乙酸乙酯层(10.3 g)、正丁醇层(40.5 g)和水层(12.8 g)，并储存于-20℃的冰箱中。本实验中使用的小鼠剂量是基于已确定具有快速抗抑郁作用的栀子乙醇提取物的等效剂量(270 mg/kg)(Zhang et al.,2015)。对照组小鼠接受生理盐水处理。在慢性轻度应激(CMS)实验中，暴露于CMS并接受生理盐水处理的小鼠作为赋形剂组。氯胺酮作为阳性对照组。

3.3悬尾试验

悬尾试验被广泛应用于临床前抗抑郁药物的测试中，使用计算机化设备进行，可以同时测试四只动物。在一个声学和视觉隔离的房间内，将一只单独的老鼠用胶带悬挂在离地面50 cm的位置，胶带固定在离尾尖约1 cm的地方。动物的活动行为被记录下来。使用ANY-maze软件对测试时间内最后4 min内不动的总持续时间进行分析。

3.4强迫游泳试验

强迫游泳实验也是测量啮齿动物抑郁样反应的常用行为测试之一。在该实验中，将小鼠从它们的笼子中取出，置于一个透明的玻璃水箱中(高50 cm,直径30 cm)，其中装满40 cm的水，然后让其自由游泳6 min。实验结束时，将小鼠从水中取出，用纸巾擦干，然后放回它们的笼子中。当老鼠漂浮在水中而没有挣扎，并且只进行必要的动作以保持头部在水面上时，被认为是处于不动状态。使用Any-maze软件对测试周期内最后4 min的总不动时间进行分析。

悬尾试验和强迫游泳实验都被用于筛选栀子抗抑郁有效成分，并测试其在慢性应激小鼠中的快速抗抑郁作用。

3.5慢性轻度应激模型

慢性轻度应激模型被用于进一步评估显示快速抗抑郁潜力组分的行为反应。按照文献方法(Schweizer et al.,2009)，将小鼠单独安置并接受为期3周的轻度应激。在每个周期中，每天随机选择一种应激刺激，共有7种刺激顺序：24 h的食物和水剥夺，倾斜角度为45°的笼子24 h,40 min的笼子摇晃(200 r/min),20 h的笼子污染(锯屑床上加水200 mL),12 h的过夜照明，6 h的试管束缚。所有接受慢性轻度应激的小鼠被单独囚禁，直到实验结束。对照组小鼠未接受应激处理。在最后一个CMS周期后的一天，小鼠按照OFT (开放场测试)、TST (悬尾试验)、FST (强迫游泳试验)和SPT (糖水偏好实验)的顺序进行行为测试，测试之间至少间隔2 h。OFT、TST和FST在单次给药后的第二天进行测试。第二天早上进行SPT测试。

3.6开场试验

开放场测试(open field test,OFT)被用于评估动物在开放区域内的运动活动和焦虑样行为。在测试中，将小鼠放置在一个方形竞技场(40 cm×40 cm×15 cm)，测量其自发运动活动，包括行进的总距离(以cm为单位)。

3.7蔗糖偏爱试验

蔗糖偏爱试验(sucrose preference test,SPT)参考了已出版文献方法(Opal et al.,2014)，并对其稍作修改。简单来说，将小鼠单独放置并暴露于蔗糖溶液中72 h，然后去除水源18 h，并将其置于两个相同的瓶子中2 h，其中一个瓶子装有1%的蔗糖溶液，另一个瓶子装有水。3 h后测量蔗糖溶液或水的体积。蔗糖偏好被定义为在3 h试验中蔗糖溶液的体积与总体积(蔗糖溶液+水)的比例，并以个体动物的体重进行归一化。在将小鼠分配给药物治疗组之前进行蔗糖偏好测试，并每周监测1次。

3.8蛋白质印迹

将整个海马区溶解于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中。使用BCA比色法测定蛋白质浓度。使用15%SDS-PAGE(BDNF)和8%SDS-PAGE (TrkB)电泳分离蛋白质裂解物，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上。在用1%牛血清白蛋白封闭1 h后，将膜与BDNF、TrkB和β-tubulin抗体在室温(25℃)下孵育1 h。随后用TBST冲洗膜3次(每次洗涤10 min)，然后与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育1 h。再次用TBST洗涤膜3次(每次洗涤10 min)。使用Immobilon Western化学发光HRP底物对印迹进行可视化。将BDNF和TrkB的表达量与β-tubulin进行归一化。所有实验重复3次。

3.9数据处理

数据以平均值±标准误(SEM)表示。统计分析使用单因素方差分析(ANOVA)结合LSD比较试验进行独立样本的比较，或者使用重复测量的ANOVA结合LSD事后检验进行重复测量数据的比较。统计分析使用SPSS 20.0软件进行。在P<0.05时，差异被认为具有统计学意义。

作者贡献

姚启萍是本研究的执行人，负责数据分析和初稿写作以及文章修改和校对；赵静参与实验操作和数据整理；季丹参与实验材料的准备和处理。全体作者都阅读并同意最终的文本。

文章来源:姚启萍,赵静,季丹.栀子活性物质石油醚层组分快速抗抑郁作用及机制[J].分子植物育种,2023,21(16):5491-5496.DOI: