丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种多年生直立草本植物，属于唇形科鼠尾草属，其干燥的根和根茎被广泛应用于传统中药中。丹参具有凉血消痈、活血祛瘀和通经止痛的功效，可治疗症瘕积聚、月经不调、胸痹心痛、热痹疼痛、心烦不眠、脘腹胁痛等疾病。丹参最早记载于《神农本草经》，并在全国各地的临床实践中得到广泛使用(Jia et al.,2019;Cheng et al.,2021)。丹参可单独使用，也可与其他中药组合使用，均具有疗效。丹参作为最常用的传统药物之一，已被应用于治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、神经、代谢紊乱、肺部疾病、心血管疾病、炎症性疾病、妇科疾病、肝脏疾病和肾脏疾病等(Su et al.,2015;Wang et al.,2017;Ren et al.,2019;Yin et al.,2021)。

丹酚酸B (salvianolic acid B,Sal B)是从丹参中提取的最丰富的水溶性酚类化合物(图1)。丹酚酸B具有抗氧化应激、炎症反应、肝纤维化、衰老和抗癌等多种功能(Qin et al.,2019;Guo and Wang,2022;Xiao et al.,2022)。体外和体内的心肌损伤模型研究已经证实了丹酚酸B对心脏的保护作用(Ho and Hong,2011;Yu et al.,2017)。然而，目前尚未有学者报道丹酚酸B对运动性心肌损伤的效果。

最近的研究显示，丹酚酸B通过上调Nrf2信号通路抑制心肌梗死大鼠中的铁死亡，从而发挥心脏保护作用(Shen et al.,2022)。丹酚酸B还通过降低GPX4的泛素蛋白酶体降解，抑制心肌缺血/再灌注损伤中的铁死亡(Xu et al.,2023)。基于这些发现，我们推测丹酚酸B可能通过抑制铁死亡途径来减轻运动性心肌损伤。因此，本研究旨在探讨丹参中的活性成分丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠的保护作用，并研究其对铁死亡途径的影响。

1、结果与分析

1.1丹酚酸B通过抑制铁死亡改善运动性心肌损伤大鼠心功能

心功能参数的检测结果显示，与NC组相比，M组的LVEF显著降低，而LVIDd和LVIDs显著升高(P<0.05)。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的LVEF呈丹酚酸B剂量依赖性显著升高，而LVIDd和LVIDs呈丹酚酸B剂量依赖性显著降低(P<0.05)。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的LVEF显著降低，而LVIDd和LVIDs显著升高(P<0.05)(图2)。这些结果表明，丹酚酸B通过抑制铁死亡改善了运动性心肌损伤大鼠的心功能。

图1丹酚酸B的化学结构   

1.2丹酚酸B通过抑制铁死亡减轻运动性心肌损伤大鼠心肌损伤

血清心肌损伤指标的检测结果显示，与NC组相比，M组的血清LDH、CK和cTnI水平显著升高(P<0.05)。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的血清LDH、CK和cTnI水平呈丹酚酸B剂量依赖性显著降低(P<0.05)。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的血清LDH、CK和c TnI水平显著升高(P<0.05)(图3)。这些结果提示，丹酚酸B通过抑制铁死亡减轻了运动性心肌损伤大鼠的心肌损伤。

1.3丹酚酸B通过抑制铁死亡改善运动性心肌损伤大鼠血清心肌形态并抑制细胞凋亡

HE染色的结果显示，与NC组相比，M组大鼠的心肌形态出现异常。肌纤维排列不规则，部分断裂，肌细胞变形、肿胀，并伴有炎性细胞浸润。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的心肌组织形态呈丹酚酸B剂量依赖性改善。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的心肌组织损伤加重(图4)。

TUNEL染色和RT-qPCR检测结果显示，与NC组相比，M组的心肌组织TUNEL阳性率和Bax mR-NA水平显著升高，而Bcl-2 mRNA水平显著降低(P<0.05)。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的心肌组织TUNEL阳性率和Bax mRNA水平呈丹酚酸B剂量依赖性降低，而Bcl-2 mRNA水平呈丹酚酸B剂量依赖性升高(P<0.05)。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的心肌组织TU-NEL阳性率和Bax mRNA水平显著升高，而Bcl-2mRNA水平显著降低(P<0.05)(图5;图6)。这些结果提示，丹酚酸B通过抑制铁死亡改善了运动性心肌损伤大鼠的血清心肌形态，并抑制了细胞凋亡的发生。

图2丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心功能参数的

图3丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌损伤指标的影响   

图4丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌形态的影响  

1.4丹酚酸B通过抑制铁死亡抑制运动性心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激

MDA和GSH检测结果显示，与NC组相比，M组的心肌组织MDA水平显著升高，而GSH水平显著降低(P<0.05)。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的心肌组织MDA水平呈丹酚酸B剂量依赖性降低，而GSH水平呈丹酚酸B剂量依赖性升高(P<0.05)。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的心肌组织MDA水平显著升高，而GSH水平显著降低(P<0.05)(图7)。这些结果提示，丹酚酸B通过抑制铁死亡抑制了运动性心肌损伤大鼠心肌组织的氧化应激反应。

1.5丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌组织铁死亡相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与NC组相比，M组的心肌组织中GPX4、FTH1和FPN1蛋白的表达水平显著降低，而PTGS2蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。与M组相比，L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组的心肌组织中GPX4、FTH1和FPN1蛋白的表达水平呈丹酚酸B剂量依赖性增加，而PTGS2蛋白的表达水平呈丹酚酸B剂量依赖性降低(P<0.05)。与H-Sal B组相比，H-Sal B+GPX4-IN-3组的心肌组织中GPX4、FTH1和FPN1蛋白的表达水平显著降低，而PTGS2蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)(图8)。这些结果提示，丹酚酸B调节了运动性心肌损伤大鼠心肌组织中与铁死亡相关的蛋白表达水平。

2、讨论

过度运动可能导致运动性心肌损伤，目前缺乏相关的预防和治疗药物(Oláh et al.,2015)。丹参是一种具有心脏保护作用的植物，其作用与其富含的多种生物活性成分有关，其中包括丹酚酸B (Ho and Hong,2011;Yu et al.,2017)。本研究首次探索了丹酚酸B在运动性心肌损伤大鼠中的保护作用。细胞凋亡是运动性心肌损伤的主要病理变化(Wan et al.,2017)，本研究显示，丹酚酸B剂量依赖性地抑制了运动性心肌损伤大鼠心肌组织的细胞凋亡。氧化应激在运动性损伤中起着关键作用，过度运动会导致氧耗量的增加，进而产生大量的活性氧自由基(ROS)，破坏细胞膜结构并影响线粒体功能，最终导致细胞凋亡(Loboda et al.,2016)。本研究显示，丹酚酸B能有效抑制运动性心肌损伤大鼠心肌组织的氧化应激反应。上述结果表明，丹酚酸B可能具有良好的抗运动性心肌损伤作用，其机制与其抗氧化活性密切相关。

图5丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响   

铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡形式，其发生与铁依赖性脂质过氧化有关(Stockwell et al.,2017)。铁死亡参与了多种心脏疾病的病理过程(Chen et al.,2021;Huang et al.,2021)。谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)是抵抗脂质过氧化的主要内源性抗氧化酶，也是铁死亡的关键调节因子(Yang and Stockwell,2016)。在铁死亡过程中，胱氨酸摄取受到溶质载体家族7成员11 (SLC7A11)的抑制，导致谷胱甘肽(GSH)合成减少(Zhang et al.,2019)。GSH的减少进一步消耗了GPX4，导致产生过量的脂质过氧化物和ROS，并最终引发铁死亡(Yang et al.,2014)。环氧合酶2 (PT-GS2)，也称为Cox2，是参与前列腺素生物合成的关键酶，也是铁死亡的标志物(Amadio et al.,2017)。铁死亡过程中伴随着PTGS2的上调(Stockwell et al.,2017)。本研究显示，丹酚酸B剂量依赖性地抑制了运动性心肌损伤大鼠心肌组织中的铁死亡，表现为增加了心肌组织中GPX4蛋白的表达水平，降低了PTGS2蛋白的表达水平。

图6丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌组织Bax和Bcl-2转录的影响  

铁是细胞生存所必需的微量元素，不仅是血红蛋白和肌红蛋白血红素分子的组成部分，还参与多种生物学功能(Kobayashi et al.,2018)。在铁进入心肌细胞后，铁的储存和输出分别由铁蛋白重链1 (FT-H1)和铁转运蛋白1 (FPN1)介导(Jiang et al.,2020)。FTH1是调节铁储存的重要蛋白，在心脏中含量丰富，它具有亚铁氧化酶活性，能将二价铁(Fe2+)转化为三价铁(Fe3+)，从而对抗铁介导的ROS催化作用(Fang et al.,2020)。FPN1是目前唯一公认的维持心脏功能的铁输出蛋白(Lakhal-Littleton et al.,2015)。本研究显示，丹酚酸B剂量依赖性地上调了运动性心肌损伤大鼠心肌组织中FTH1和FPN1蛋白的表达水平，从而改善了铁的储存和输出。

图7丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激指标的影响   为了验证丹酚酸B是否通过抑制铁死亡途径发挥心肌保护作用，本研究结果显示，GPX4-IN-3削弱了丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌组织铁死亡途径的抑制作用，并减弱了丹酚酸B的心脏保护作用。这与其他研究报道的丹酚酸B抑制铁死亡的作用一致(Shen et al.,2022;Xu et al.,2023)。这些结果充分说明了丹酚酸B通过抑制铁死亡途径来减轻大鼠运动性心肌损伤。

综上所述，本研究结果表明丹酚酸B通过抑制铁死亡途径来减轻大鼠运动性心肌损伤。丹酚酸B可能是一种天然药物，具有良好的开发前景，可用于预防和治疗运动性心肌损伤。

3、材料与方法

3.1实验动物来源和分组及处理

7～8周龄(体重260～320 g)的SPF级别雄性SD大鼠由武汉云克隆动物有限公司提供[生产许可证:SCXK (鄂)2023-0021]。大鼠在屏障环境中饲养(温度24℃～26℃，湿度50%～60%)。

将大鼠分为以下组别：NC组、M组、L-Sal B组、M-Sal B组、H-Sal B组和H-Sal B+GPX4-IN-3组，每组20只。NC组和M组大鼠口服2 mL生理盐水。L-Sal B组、M-Sal B组和H-Sal B组大鼠口服2 mL浓度分别为10、20和40 mg·kg-1·d-1的丹酚酸B溶液(溶解于生理盐水)。H-Sal B+GPX4-IN-3组大鼠口服2 mL浓度为40 mg·kg-1·d-1的丹酚酸B溶液，并腹腔注射0.1 mL浓度为15 mg/kg的铁死亡诱导剂GPX4-IN-3 (溶解于10%DMSO和90%玉米油的混合溶液)。连续给药4周。丹酚酸B的给药剂量参考文献(Xu et al.,2023)。丹酚酸B (HY-N1362,纯度99.92%)和铁死亡诱导剂GPX4-IN-3 (HY-141809)购自美国MCE公司。

3.2实验动物模型的建立

本实验采用负重力竭游泳法诱导运动性心肌损伤大鼠模型。NC组大鼠作为健康对照组，保持安静饲养。其他组的大鼠均进行负重力竭游泳。在灌胃丹酚酸B后的2 h内进行负重力竭游泳运动，具体方案如下：将重量为体重的5%的铅坠分别系在大鼠尾根部，然后将大鼠放置在尺寸为50 cm×50 cm×40 cm、水深为40 cm、水温为30℃的有机玻璃水槽中进行游泳。当大鼠的头部沉入水中超过10 s且无法自行浮出水面时，被认定为力竭。每天进行两次游泳，连续进行5 d，共计4周。

3.3相关参数和指标测定

心功能参数测定：使用Visual Sonics VEVO 3 100超高分辨率小动物超声成像系统检测大鼠的左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs)。

血清心肌损伤指标检测：在异氟醚吸入麻醉下，固定大鼠四肢并剪开腹腔，从腹主动脉采集血液，然后进行离心分离以获取血清(离心条件:3 000 r/min,4℃,10 min)。采用比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量，采用增强免疫比浊法检测心肌肌钙蛋白I (cTnI)的含量。

图8丹酚酸B对运动性心肌损伤大鼠心肌组织铁死亡相关蛋白表达的影响  

心肌组织MDA和GSH检测：将心肌组织与样品制备液按1:9的质量体积比混合制备匀浆，然后进行离心分离以获取上清液(离心条件:12 000 r/min,4℃,5 min)。采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)的含量，使用紫外分光光度计测量532 nm波长处的光密度值。采用微板法检测谷胱甘肽(GSH)的活性，使用紫外分光光度计测量405 nm波长处的光密度值。

3.4心肌组织HE染色和TUNEL染色

对处死大鼠进行解剖，取出心脏后使用4%多聚甲醛固定，并制备4μm厚的心肌切片。按照制造商的说明书对切片进行HE染色和TUNEL染色。使用奥林巴斯BX63共聚焦显微镜观察染色后的切片。

3.5 RT-q PCR分析

使用RNAiso Plus提取心肌的总RNA，并使用M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。采用Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪和SYBR Green Master Kit进行PCR。PCR条件为：95℃5 min,95℃30 s,62℃20 s,72℃30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达水平。

3.6 Western blot分析

使用RIPA缓冲液提取心肌组织总蛋白，使用BCA法进行定量。将样品在10%SDS-PAGE中电泳，然后转移到PVDF膜。使用5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h，随后与GPX4、PTGS2、铁蛋白重链1 (FTH1)、铁转运蛋白1 (FPN1)和GAPDH的一抗(1:1 000稀释)在4℃下孵育过夜。接着与Ig G H&L (HRP)的二抗(1:1 000稀释)在室温下孵育2 h，最后使用ECL显色方法。使用Image Lab 4.1软件测量灰度值，其中GAPDH用作蛋白负荷控制。

3.7统计分析

用SPSS 21.0软件进行数据分析，单因素方差分析比较不同组之间的差异。显著性水平设定为P<0.05。

作者贡献

李昊是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作与修改均由李昊独立完成。作者阅读并同意最终的文本。

文章来源:李昊.丹参活性成分丹酚酸B对运动性心肌损伤的保护作用及机制[J].分子植物育种,2023,21(19):6531-6538.