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绞股蓝总苷对人脑微血管内皮氧糖剥夺的影响

2023-12-08 234 上传者：管理员

摘要：目的探索绞股蓝总苷对氧糖剥夺诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)氧化应激反应的影响。方法体外培养HBMEC,使用不同绞股蓝总苷浓度10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L干预HBMEC,通过CCK8法筛选绞股蓝总苷最佳剂量。建立氧糖剥夺(OGD)模型，将细胞随机分为Control组、OGD组、OGD+GP(绞股蓝总苷)组。Control组用含10%FBS的DMEM培养基常规培养24 h, OGD组、OGD+GP组进行OGD培养24 h,使用荧光显微镜检测活性氧(ROS)水平，Western Blot检测超氧化物歧化酶(SOD)、醌NAD(P)H脱氢酶1(NQO1)蛋白水平，qRT-PCR检测SOD、NQO1的mRNA水平。结果与Control组比较，5组绞股蓝总苷浓度(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)干预后HBMEC活力无明显差异(P>0.05);与OGD组比较，绞股蓝总苷浓度为10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的干预后HBMEC活力差异有统计学意义(P<0.05),而绞股蓝总苷浓度为100 mg/L干预后细胞活力较高，因此绞股蓝总苷最佳剂量为100 mg/L。OGD条件下，绞股蓝总苷降低HBMEC的ROS表达；与OGD组比较，使用绞股蓝总苷干预后，HBMEC的SOD和NQO1蛋白及水平mRNA均升高(P均<0.05)。结论绞股蓝总苷对OGD后的HBMEC有抗氧化应激作用，其机制可能与降低ROS,上调SOD、NQO1水平有关。

关键词：
人脑微血管内皮细胞
氧化应激
活性氧
绞股蓝总苷
超氧化物歧化酶
醌NAD(P)H脱氢酶1
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缺血性脑卒中致残率高，幸存患者长期存在严重的身体和认知功能障碍[1]。当脑缺血后，脑组织氧化与抗氧化系统失衡，细胞内线粒体氧化磷酸化受抑制，ATP生成障碍，活性氧(reactive oxygen species, ROS)急剧增加，细胞结构造成严重损害，即产生氧化应激，加快细胞凋亡、坏死等。ROS诱导的氧化应激可致血脑屏障内皮细胞的紧密连接受损[2]、神经损伤加重、脑梗死体积扩大，而使用抗氧化剂治疗可减轻内皮细胞损伤及血脑屏障通透性、减少神经细胞坏死[3],从而改善神经功能损伤。中医有关中风的治疗多强调活血通络、醒神开窍等，已逐渐显示出重要地位[4,5,6,7]。绞股蓝是一种传统中药，绞股蓝总苷具有很好的抗氧化作用[8],但笔者发现其在缺血性脑卒中的保护机制尚不明确。本研究通过氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)条件下培养人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC),模拟缺血性脑卒中的病理过程，并应用绞股蓝总苷进行干预，旨在探讨其中的抗氧化机制。

1、材料与方法

1.1细胞与试剂

HBMEC购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，绞股蓝总苷购自上海源叶生物科技有限公司，蛋白提取试剂盒购自美国Thermo;引物购自美国Promega公司。兔抗超氧化物歧化酶(SOD)单克隆抗体、兔抗编码还原型辅酶/醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinone oxido reductase, NQO1]单克隆抗体购自Abcam公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；0.9%氯化钠溶液购自石家庄第四制药厂，DMEM培养液购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；ROS试剂盒和DCFH-DA购自中国博奥森公司，荧光探针购自中国博奥森公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，PCR试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2细胞OGD模型的建立及分组

HBMEC复苏后，使用10%FBS的DMEM培养，待细胞长至对数期时，将细胞随机分为Control组、OGD组、OGD+GP组。Control组为对照，HBMEC应用含10%FBS的DMEM培养基常规培养24 h, OGD组为OGD组、OGD+GP组为OGD与绞股蓝总苷干预组，2组均进行OGD培养24 h,条件：无糖DMEM培养液，缺氧培养箱，37℃、CO2体积分数5%、N2体积分数95%、湿度97%。其中OGD+GP组，加绞股蓝总苷100 mg/L共孵育细胞。

1.3 CCK-8测定细胞活力和细胞毒性

按照说明书使用CCK-8测定HBMEC活力，将对数期生长的HBMEC接种于96孔板中，将不同浓度的绞股蓝总苷：10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L放入相应的孔中。在正常氧合培养箱中培养24 h后，每孔加入10μl CCK-8溶液测定毒性。连续OGD 10 h后，用CCK-8测定药物疗效。实验至少重复3次。

1.4荧光显微镜检测ROS水平

DCFH-DA探针检测HBMEC内ROS水平，培养24 h后，吸出上清液，PBS清洗3次，在24孔板中加入DCFH-DA探针(10μmol/L),置于37℃培养箱孵育30 min,立即用荧光显微镜观察ROS荧光，采集图像。

1.5 Western Blot检测SOD、NQO1水平

各组HBMEC用RIPA裂解，提取总蛋白，13 000 r/min、4℃ 离心15 min。取50μg蛋白，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，切胶后将蛋白转移至PVDF膜，放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭2 h,加入一抗，SOD(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),室温振摇1 h,后转入4℃过夜。次日用TBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗(1∶5 000),室温孵育2 h, TBST洗膜3次，ECL显色，将PVDF膜放置到凝胶成像分析系统中成像。

1.6 qRT-PCR检测SOD、NQO1的mRNA水平

应用Trizol试剂，提取总RNA,按说明书步骤提取组织中总RNA后并检测总浓度，应用逆转录试剂盒，按照说明书将RNA逆转录成cDNA(42℃,60 min,再于70℃,5 min),cDNA稀释至50μl,按照试剂盒说明书操作，检测SOD、NQO1的mRNA水平，qRT-PCR检测条件为95℃2 min; 95℃15 s, 60℃15 s, 72℃1 min; 40循环。引物如下：SOD:5’-GGGCATCATCAATTTCGA-3’/5’-AGCCTGCTGTATTATCTCCA-3’;NQO1:5’-GAAGAGCACTGATCGTACTGGC-3’/5’-GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-3’;β-actin: 5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’/GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。

1.7统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件，符合正态分布的计量资料以x¯±s

表示，采用t检验，不符合正态分布采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1确定绞股蓝总苷的有效浓度

与Control组比较，5组绞股蓝总苷浓度干预后HBMEC活力无明显差异(P>0.05),提示5种浓度绞股蓝总苷对HBMEC无明显毒性。与OGD组比较，绞股蓝总苷浓度为10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的干预后HBMEC活力差异有统计学意义(P<0.05)。绞股蓝总苷浓度为100 mg/L干预后细胞活力较高，因此选取绞股蓝总苷浓度为100 mg/L作为有效浓度进行接下来的实验。见表1、2。

表1不同GP浓度干预HBMEC的细胞活力%,x¯±s

2.2绞股蓝总苷减少OGD后HBMEC的ROS产生

OGD组HBMEC的荧光强度较高，提示OGD后HBMEC发生氧化应激反应，ROS水平升高，应用不同浓度绞股蓝总苷后，HBMEC的荧光强度较OGD组降低，尤其应用绞股蓝总苷浓度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L组的HBMEC荧光强度明显降低，提示绞股蓝总苷可降低HBME COGD后ROS水平。见图1。

表2不同GP浓度干预OGD后HBMEC的细胞活力%,x¯±s

图1绞股蓝总苷对氧糖剥夺后HBMEC中ROS表达的影响

2.3绞股蓝总苷上调OGD后HBMEC的SOD及NQO1蛋白表达水平

与Control组比较，OGD组SOD蛋白水平有降低的趋势，NQO1蛋白水平有上升的趋势，与OGD组比较，OGD+GP组HBMEC的SOD、NQO1蛋白水平均上调明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3,图2。

表3绞股蓝总苷对HBMEC中SOD和NQO1蛋白及mRNA相对表达量的影响x¯±s

图2绞股蓝总苷对氧糖剥夺后HBMEC中SOD和NQO1蛋白图

2.4绞股蓝总苷上调OGD后HBMEC的SOD及NQO1的mRNA表达水平

与Control组比较，OGD组SOD的mRNA水平有降低的趋势，NQO1的mRNA水平有上升的趋势，与OGD组比较，OGD+GP组SOD、NQO1的mRNA水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

3、讨论

氧化应激在缺血性脑卒中的发病过程中起到重要的作用，抗氧化治疗可有效保护神经元，并减轻患者神经功能损害。现代药理证明绞股蓝主要药效成分为绞股蓝总苷，具有多种效应，如防治血脂升高[9]、血糖升高、抑制肿瘤的生长、抗御神经系统损伤、提高抵抗力、延缓衰老和固护肝脏等多种能效作用[9]。研究显示，绞股蓝总苷可降低患者体内血浆脂质过氧化物水平[10],动物实验也证明绞股蓝总苷可增强力竭运动小鼠抗氧化因子SOD的活性，达到保护组织免受自由基损伤的作用，保护心肌在缺血缺氧中的损伤[11],同时发现，绞股蓝对慢性脑缺血海马神经元具有较好的神经保护功能[12]。HBMEC是血脑屏障最重要的组成部分，在脑梗死病理生理机制中发挥重要作用，因此推测绞股蓝总苷对可能通过降低HBMEC的氧化应激反应对脑组织起到保护作用。

体外培养HBMEC,通过OGD模拟脑梗死缺血缺氧微环境，发现在缺氧缺糖条件下可导致HBMEC活性下降，应用绞股蓝总苷组，细胞失活状态得到改善，本研究筛选出最佳药物剂量为100 mg/L。研究显示绞股蓝总苷及其活性化合物在体外和体内都能预防缺氧引起的损伤，减轻血脑屏障破坏[13]。在OGD条件下，用绞股蓝总苷培养HBMEC,可明显提升细胞的活力：内皮细胞是血脑屏障最主要的构成部分，它的损伤可直接导致血脑屏障渗透性增加，根据上述推测绞股蓝总苷可能在脑缺血缺氧后保护内皮细胞，从而发挥血脑屏障的保护作用。研究已表明血脑屏障的破坏与ROS引起的氧化应激密不可分[14],据此进一步检测ROS表达情况，发现在OGD条件下HBMEC的ROS水平明显升高，而应用绞股蓝总苷后，ROS的表达降低，说明绞股蓝总苷可通过降低ROS水平，减轻缺糖缺氧情况下内皮细胞的氧化应激，从而保护HBMEC。

ROS可通过紧密连接中闭合蛋白的分布和表达破坏血脑屏障的完整，还可以激活介导血脑屏障功能障碍的下游通路影响其功能[15]。血脑屏障是最重要的生理屏障，由脑微血管内皮细胞及其表面的紧密连接、周围的星形胶质细胞、周细胞和基底膜组成。血脑屏障通过调节体循环物质的进出来维持脑微环境的稳态。血脑屏障的破坏时渗透性增加，是导致缺血性脑损伤加重的主要因素[16]。当脑组织缺血缺氧时，线粒体氧化磷酸化受抑制，细胞内ATP产生受限，能量依赖性的Ca2+泵、Na+泵不能及时将细及胞内的Ca2+及Na+运出，同时ROS水平会急剧增加，导致脑细胞凋亡、炎症及坏死。ROS招募白细胞，刺激白细胞和内皮细胞产生粘附分子，引起细胞吞噬和免疫反应，炎性细胞积累，进一步加重脑损伤[17],这一系列的级联损伤反应，导致神经元细胞死亡、神经炎症和血管破坏，进而加重脑功能障碍[18]。本研究结果提示绞股蓝总苷可通过降低ROS水平减轻HBMEC损伤，因此绞股蓝总苷有可能减轻血脑屏障的破坏，从而发挥神经保护作用。

氧化应激发生时，细胞内的抗氧化系统也发生改变。研究显示，心肌缺血再灌注损伤时，使用绞股蓝总苷预处理可保护心肌细胞活力，减少氧化应激反应，保护心肌细胞；绞股蓝总苷也可通过ROS表达减少，SOD表达增加降低氧化应激水平[19,20]。因此我们推测绞股蓝总苷可能提高细胞内抗氧化因素，短暂性脑缺血发作患者应用神经保护剂后可提高SOD活力，通过减少脂质过氧化物及减轻自由基介导的毒性，增加抗氧化能力，进而改善脑缺血损伤后神经功能缺损评分，促进损伤后神经功能恢复[21]。NQO1是还原型谷胱甘肽的合成限速酶，对抗氧化应激能力的提高有重要作用[22],脑缺血后，NQO1表达明显上升，减少ROS的形成，使细胞内氧化还原反应趋于平衡，减轻神经细胞的氧化应激损伤。进一步检测HBMEC在不同条件下SOD及NQO1蛋白的情况，结果显示在OGD时应用绞股蓝总苷，可提高内皮细胞的抗氧化因子SOD及NQO1蛋白及mRNA的表达，这说明能量缺乏时，绞股蓝总苷可在转录水平提高内皮细胞的抗氧化能力。同样也有研究显示与野生型动物相比，缺乏SOD的小鼠极易发生短暂性局灶性脑缺血，且血管源性水肿更严重，死亡率更高，SOD表达升高后可减轻脑缺血后血脑屏障损伤[23]。NQO1是人体Ⅱ相抗氧化酶和重要的抗氧化物质，可催化ROS的还原反应[24],既往研究表明在缺血缺氧缺乏条件下内皮细胞内NQO1升高，起到脑保护作用，结合我们研究结果表明应用绞股蓝总苷后上调NQO1表达，从而发挥保护作用。

综上所述，绞股蓝总苷可在OGD后通过降低ROS及上调抗氧化因子SOD及NQO1的表达，调节HBMEC内氧化应激水平，保护内皮细胞。

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基金资助:国家自然科学基金青年基金项目(编号:82001229);河北省医学科学研究课题计划项目(编号:20210914,20230293);衡水学院高层次人才科研启动基金项目(编号:2019GC18);