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葛根沙棘颗粒对急性酒精性肝损伤小鼠的护肝作用研究

2024-01-15 173 上传者：管理员

摘要：目的研究葛根沙棘颗粒对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用。方法将60只昆明小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、剂量组（包括低、中、高3个剂量组，葛根沙棘颗粒给予剂量分别为0.25、0.50、1.50 g/kg），每组12只。除空白对照组外，其他组均建立急性酒精性肝损伤模型，剂量组给予葛根沙棘颗粒连续灌胃30 d。实验期结束测定小鼠肝组织中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）的含量，并进行肝脏病理组织学检查。结果模型组小鼠肝脏MDA、GSH、TG的含量及病理学评分与空白对照组相比差异有统计学意义（P均<0.05），表明急性酒精性肝损伤模型造模成功。葛根沙棘颗粒高剂量组小鼠肝组织匀浆MDA含量为（2.44±0.39）nmol/mg、GSH为（0.25±0.07）mg/g、TG为（0.022±0.007）mmol/g、病理评分为（2.75±0.97）分，模型对照组MDA为（3.27±0.68）nmol/mg、GSH为（0.17±0.09）mg/g、TG为（0.029±0.005）mmol/g、病理评分为（3.83±0.39）分；与模型对照组相比，葛根沙棘颗粒高剂量组能够降低酒精性肝损伤小鼠肝组织中MDA、TG含量，升高GSH含量，病理评分降低（P均<0.05）。结论葛根沙棘颗粒对急性酒精性肝损伤小鼠具有保护作用。

关键词：
急性酒精性肝损伤
护肝
肝病
葛根沙棘
饮酒
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随着社会和经济发展，人们生活水平不断提高的同时生活压力逐步增大，饮酒已成为一种常见行为，且饮酒人群趋向年轻化。长期或短期内大量饮酒都会造成人体肝脏的损伤甚至是肝脏致病影响，进入体内的乙醇90%以上在肝脏代谢，酒精性肝损伤疾病是临床上常见的肝病之一。有研究表明重度饮酒者中80%以上有一定程度的脂肪肝，10%～35%可发展成酒精性肝炎，10%～20%将发展成肝硬化[1,2]，当前酒精性肝病已成为第二大类肝病，严重危害人类健康和社会发展，如何防治酒精性肝损伤已成为全球关注的公共卫生问题。目前临床上治疗酒精性肝病大多采取戒酒、营养支持，严重者可增加糖皮质激素、美多他辛等药物治疗，但均无特效疗法，且药物治疗存在较大的副作用[3]。具有多成分、多靶点、安全性高等特点的中药和植物提取物被广泛用于防治酒精性肝病，并显示出一定效果[4]。

葛根沙棘颗粒是以药食同源的葛根、沙棘、黄精、枳椇子、决明子和山楂为原料制作而成。葛根主要成分为黄酮类化合物和皂苷两大类，是中国传统医学中最具代表性的解酒中草药；沙棘中的黄酮对自由基有较高的清除能力，对小鼠急性肝损伤有保护作用；黄精具有抗氧化、降血脂血糖、调节免疫等多种作用；枳椇子含皂苷、黄酮、生物碱等成分，有抗脂质过氧化、保肝、解酒毒等作用；决明子主要含蒽醌类和萘并吡咯酮类两种成分，具有通便、降血压、调节血脂、增强机体免疫力、保肝、明目、抑菌及抗衰老等多方面作用；山楂含有黄酮类、纤维素、鞣制、有机酸类、甾体和三萜等，其中黄酮类为其主要活性成分，黄酮类具有抗动脉硬化、抗氧化、降血糖等作用，其提高组织抗氧化酶活性，抑制自由基损伤，防治脂质过氧化作用尤为突出[5,6,7,8,9,10,11,12]。本研究通过建立小鼠酒精性肝损伤模型，观察葛根沙棘颗粒对酒精性肝损伤的辅助保护作用，探讨相关的作用机制，为开发更多的解酒护肝产品提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 样品

葛根沙棘颗粒由某药业有限公司生产，样品为颗粒，5 g/袋。人体推荐量为每日3次，每次1袋。

1.2 实验动物

昆明种小鼠，SPF级，雄性60只，体重18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：11400700074626。实验动物房许可证号：SYXK（豫）2017-0009。

1.3 主要试剂与仪器

无水乙醇（安徽安特生物化学有限公司），丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究），谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究），甘油三酯（TG）试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）；全自动生化分析仪ADVIA1200（德国拜耳），高速冷冻离心机Allegrax-22R（美国贝克曼），组织匀浆机T25（德国IKA），分析天平BT25S（德国赛多利斯），半自动生化分析仪KY-2000（日本日立），光学显微镜Eclipse E100（日本尼康）。

1.4 方法

1.4.1实验动物分组及给药

实验动物随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、模型对照组和3个剂量组。3个剂量组分别为人体推荐量的5、10、30倍，即0.25、0.50、1.50 g/kg，分别称取受试样品1.25、2.50、7.50 g加蒸馏水至100 mL，作为低、中、高3个剂量组的受试液，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。经口给予每日1次，灌胃容量为20 mL/kg，每周称2次体重，根据体重变化调整受试物给予量，连续给予30 d。本实验经本单位实验动物伦理委员会审批通过。

1.4.2样本处理

30 d后模型对照组和各剂量组均给予1次体积分数为50%的乙醇制造酒精肝损伤模型（灌胃容量为12 mL/kg），空白对照组给予蒸馏水，禁食16 h称重后处死小鼠，立即剖取肝脏用4℃生理盐水冲洗后滤纸吸干，冷藏保存。取部分脏组织制备5%、10%的肝组织匀浆，4℃离心（3 000 rpm,15min），取上清液待测。另肝左叶中部横切面取材后用10%甲醛固定1周，冰冻切片，苏丹III染色后镜检。

1.4.3指标测定

5%肝匀浆上清液测定MDA,10%肝匀浆上清液测定GSH和TG。MDA、GSH的测定均按照试剂盒说明，TG采用全自动生化分析仪测定。

1.4.4肝脏病理组织学检查

光学显微镜40×物镜下观察各组肝组织切片，从切片一端视野开始记录细胞的病理变化，连续观察整个组织切片，主要观察脂滴在肝组织的分布、范围和面积并进行评分。评分标准：肝细胞内脂滴散在，稀少计0分；含脂滴的肝细胞不超过1/4计1分；含脂滴的肝细胞不超过1/2计2分；含脂滴的肝细胞不超过3/4计3分；肝组织几乎被脂滴代替计4分。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量数据符合正态分布，以（±s）表示。模型对照组与空白对照组比较用t检验，模型对照组与各剂量组比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 葛根沙棘颗粒对实验小鼠体重的影响

各组小鼠的初、中、末期体重组间比较无统计学差异（P>0.05），说明在本实验条件下葛根沙棘颗粒对实验动物的体重无明显影响。见表1。

2.2 小鼠酒精肝损伤模型造模

模型对照组小鼠肝组织匀浆MDA、TG含量高于空白对照组，GSH活性低于空白对照组（P均<0.05）；小鼠肝脏病理组织学检查发现，空白对照组小鼠肝组织胞浆内几乎不存在脂滴，模型对照组肝细胞多数发生较严重的气球样变和透明性变，胞浆内有大量脂滴，肝细胞病理评分较高（P<0.05），表明小鼠酒精肝损伤模型造模成功。见表2。

表1 葛根沙棘颗粒对小鼠体重的影响

表2 空白对照组和模型对照组小鼠肝组织中MDA、GSH、TG的含量和病理评分比较

2.3 葛根沙棘颗粒对小鼠肝组织MDA、GSH、TG和肝脏病理组织学的影响

与模型对照组相比，葛根沙棘颗粒高剂量组能够降低酒精性肝损伤小鼠肝组织中MDA、TG含量，升高GSH含量（P均<0.05）。肝脏病理组织学检查发现，葛根沙棘颗粒高剂量组小鼠病理评分低于模型对照组（P<0.05）。见表3。

表3 不同剂量组小鼠肝组织中MDA、GSH、TG的含量和病理评分比较

3、讨论

肝脏是乙醇的主要代谢器官，同时也是乙醇攻击的靶器官。不同因素造成的肝损伤多与氧化应激和免疫反应紊乱有关，肝损伤诱导肝细胞生物膜系统发生脂质过氧化，进而干扰细胞内的能力代谢和诱发细胞凋亡程序等[13,14]。MDA、GSH均为调节氧化应激的重要物质，乙醇代谢物乙醛可与GSH的巯基及抗氧化酶蛋白结合，加速GSH耗竭，使机体内源性抗氧化能力减弱，清除自由基能力下降，也会使肝细胞发生脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤；此外机体氧化应激反应会使还原型GSH转变成氧化型GSH,GSH的活力及含量可间接反映机体氧化/抗氧化平衡状态。MDA是脂质过氧化的终末产物，还可与蛋白质结合形成加合物，进而激活机体的免疫反应导致肝损伤，MDA含量可反映机体内组织脂质过氧化程度，间接反映细胞氧化性损伤的程度[15]。体内脂肪酸氧化以肝脏和肌肉最为活跃，机体短期内大量摄入酒精使脂肪酸氧化发生障碍，影响脂肪代谢，导致TG在肝脏中大量合成、蓄积，最终使进入血液的TG含量亦相应增加。

本实验研究长期给予葛根沙棘颗粒对酒精性肝损伤有辅助保护作用，受试物高剂量组与模型对照组比较，小鼠肝组织MDA含量降低、GSH含量升高（P<0.05），表明从氧化应激方面看，葛根沙棘颗粒可提高肝组织的抗氧化能力，降低自由基的产生，从而减轻氧化应激反应。病理组织学检测发现，急性酒精性肝损伤小鼠肝细胞有不同程度的脂肪变性、炎性细胞浸润且与检测的肝组织中TG含量变化基本一致，高剂量组可改善小鼠脂肪病变（P<0.05）。葛根沙棘颗粒的原料为葛根、沙棘、黄精、枳椇子、决明子和山楂，原料含有大量的黄酮类、皂苷类、蒽醌类等成分，具有较强的抗氧化活性，这与实验结果一致。

综上所述，本研究结果表明葛根沙棘颗粒对乙醇所致小鼠肝损伤有保护作用，其作用机制可能与清除氧自由基和抗脂质过氧化有关，但在人体中是否有护肝功效有待进一步的人体实验研究。

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