类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种临床难治的慢性自身免疫性疾病，以对称性多关节受累为主要临床表现，其基本的病理变化为反复发作的慢性滑膜炎。目前RA的治疗手段是通过早期诊断和尽早使用抗风湿药物（diseasemodifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)[1]，治疗目标是控制在6个月内达到缓解或比较低的疾病活动性的状态，如效果不理想，再考虑连续应用生物制剂[2]。一般来说，生物制剂的精准治疗效果是显而易见的，其优势是在于针对疾病的分子特征，弊端是价格昂贵[3,4]，相比较而言中医药应用在国内的经济性与便捷性则十分突出。新的证据显示，传统草药的提取物、单体和有效成分，如黄酮类化合物、酚酸、生物碱和三萜，都被证明具有很好的抗RA活性，这些生物活性物质能够改善RA症状，通过免疫调节、炎症反应、血管生成、mi RNA和氧化应激等不同和多个靶点相互作用，其中炎症是主要的治疗靶点[5]。

从辽宁中医药大学附属医院高明利教授的经验来看，益气养阴通络（YQYY）方治疗RA的临床效果肯定，该方由黄芪30 g、石斛15 g、牛膝15g、远志15 g、金银花15 g，共5味中药构成，该方在有效缓解RA症状的同时能兼顾用药的安全性。虽然YQYY方治疗RA的宏观疗效得到了肯定，但其分子机制尚有待于揭示，因此本研究借助生物信息学及网络药理学预测YQYY方对RA的治疗作用，并且通过胶原诱导的关节炎（collagen II-induced arthritis,CIA）大鼠模型进一步验证疾病可能的发生机制和治疗靶点，为YQYY方治疗RA的临床应用提供分子层面的疗效证据支持。

1、材料与方法

1.1 芯片数据获取与差异基因识别

从GEO数据库获得临床的RA患者和健康人的滑膜组织基因芯片表达数据集GSE55235和GSE77298，利用R语言4.1.3对表达矩阵做基因名注释，对重复基因采用了平均表达量计算，并进行差异基因（different expression genes,DEGs）分析，以P.value<0.05，|log2FC|≥1.5为界值，得到DEGs并进行可视化展示。

1.2 共同DEGs的富集分析

利用Venn图绘制筛选同时出现在GSE55235、GSE77298数据集中的靶点。然后对共同DEGs进行基因本体（gene ontology,GO）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）的代谢通路的富集分析[6]。以上结果利用R语言4.1.3完成注释及结果可视化展示，其中P<0.05即认为差异有统计学意义。

1.3 筛选YQYY的活性成分和作用靶点

利用中药数据库TCM-ID、BATMAN、TCMSP，检索YQYY方中五味药物的活性成分和治疗靶点，收集整理转换基因名称。采用Cytoscape 3.9.1软件构建YQYY方活性成分与治疗靶点的关系网络[7,8]。

1.4 筛选YQYY方治疗RA的潜在靶点

找到存在于上述共同DEGs的五味中药的治疗靶点，利用和弦图找到其中至少存在于两味中药的共同DEGs治疗靶点，作为前瞻性预测YQYY方治疗RA的靶点，以备后续实验验证。

1.5 大鼠模型制备和分组给药方案

7周龄雄性SPF级SD大鼠，体质量（230±10)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物合格证号：SYXK（辽）2019-0001，经过辽宁中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准文号：21000042022010）。实验室温度控制在（22±2）℃，实验室湿度控制在（50±10)%,12 h昼夜交替循环，提供充足的标准灭菌饮用水和维持饲料。在适应性喂养后进行CIA模型的构建[9]，于饲养的第7、14天两次将鸡II型胶原（10 mg/支，美国Chondrex公司生产，货号20011）及完全弗式佐剂（10 m L/支，美国Sigma公司生产，货号F5881），多点位皮下注射于消毒后的尾根部周围，以关节炎指数[9]为标准评估关节炎的情况，每周观察大鼠四肢关节肿胀的情况，采用盲法按照0-4级的标准分级进行评分，以关节炎指数分数≥4认为CIA造模成功。将成功造模的模型大鼠32只，按随机数字表分为4组：模型组、甲氨蝶呤组、YQYY组、联合用药组（用药方案同YQYY+甲氨蝶呤组），每组按各自干预方式给药。另外空白组8只给予生理盐水每日3 m L，日1次灌胃。

1.6 CT扫描及HE病理评估

将大鼠踝关节、滑膜固定后，利用珀金埃尔默公司提供的Quantum GX扫描仪对固定后的踝关节进行CT检测，设置参数90 k V,80μA，体素20μm，构建3D成像。再用p H 7.2的EDTA脱钙液脱钙处理，将组织脱水浸蜡，包埋后切成4μm左右厚度片状，染色封片，于镜下观察。

1.7 ELISA检测

腹主动脉取血，分离血清后，利用上海古朵科技有限公司提供的ELISA试剂盒（货号：YX-401307R、YX-031816R、YX-091203R、YX-060102R）按照说明书进行加样、孵育、洗板、检测大鼠血清中TNF-α、C反应蛋白（CRP）、IL-1β、FABP4水平。

1.8 RT-q PCR检测

提取滑膜组织内RNA后，检测浓度及纯度，利用Swe Script RT I First Strand c D-NA Synthesis Kit逆转录c DNA合成试剂盒（货号：G3330）进行逆转录，最后在逆转录产物中加入引物，用2×SYBR Green q PCR Master Mix（货号：G3320）进行扩增，引物信息为GAPDH：上游CTG-GAGAAACCTGCCAAGTATG，下游GGTGGAAGAAT-GGGAGTTGCT;FABP4：上游AATGTGCGACGCCTTT-GTG，下游TCTGACCGGATGACGACCAA;PPARγ：上游TTTCAAGGGTGCCAGTTTCG，下游GGAGGCCAGCAT-GGTGTAGAT;IKKα：上游TTCTCAAGGAGCTGTTTG-GTCAC，下游TTTCTTTCTGCCTCTTTCCCTG;NF-κBp65：上游CAGATACCACTAAGACGCACCC，下游CTCCAGGTCTCGCTTCTTCACA。以上试剂及引物合成均来自武汉Servicebio公司。用2-ΔΔCt法进行RNA相对浓度测算。

1.9 Western Blotting检测

根据测定的蛋白浓度，向胶板孔中加入制备好的蛋白样品，封闭后分别加入一抗、二抗，再次孵育后显影。其中FABP4Antibody、PPARγ Antibody来自Affinity公司（货号：DF6035、AF6284);Anti-Phospho-NF-κB p65 Rabbit p Ab、Anti-NF-κB p65 Rabbit p Ab、Anti-IKK alpha Rabbit p Ab、GAPDH来自武汉Servicebio公司（货号：GB113882、GB11597、GB11292-1、GB15004）。HRP Affini Pure Goat Anti-Rabbit Ig G来自EARTHOX公司（货号：E030120）。

1.1 0 数据分析

正态数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验或单因素方差分析进行组间差异的统计学分析。非正态数据采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05认为差异有统计学意义，Prism8.0进行绘图。所有实验结果至少重复3次。

2、结果

2.1 确认差异基因

GSE55235、GSE77298数据集共有样本43人，分别为26个RA患者和17个健康人，去重后GSE55235得到852个DEGs，见Fig.1A;GSE77298得到1 563个DEGs，见Fig.1B。GSE55235的上调、下调基因展示见Fig.1C;GSE77298的上调、下调基因展示见Fig.1D。

2.2 共同差异基因的富集分析结果

筛选共同出现在两个数据集中的275个DEGs，见Fig.2A，并对其进行富集分析，首先进行GO富集分析，分为生物过程（biological process,BP）、细胞组分（cellular component,CC）、分子功能（molecular func-tion,MF）三部分，取前10的显著性分析结果，见Fig.2B-D；再进行KEGG的通路富集分析，取前20的显著性分析结果，见Fig.2E。以上排序均以矫正P值越小，差异性越显著为标准进行。

2.3 YQYY的活性成分和作用靶点

YQYY五味中药的活性成分共有123个，有效治疗靶点共有1392个，包括黄芪35个活性成分对应706个靶点，见Fig.3A；牛膝24个活性成分对应333个靶点，见Fig.3B；远志6个活性成分对应231个靶点，见Fig.3C；石斛5个活性成分对应40个靶点，见Fig.3D；金银花62个活性成分对应1 271个靶点，见Fig.3E。

2.4 YQYY方治疗RA的潜在靶点

在RA共同的DEGs中，黄芪的治疗靶点有26个，牛膝的治疗靶点有17个，石斛的治疗靶点有2个，远志的治疗靶点有6个，金银花的治疗靶点有46个。在以上治疗靶点中FABP4是黄芪、牛膝、远志、金银花的共同靶点；MMP9和PTGS2是黄芪、牛膝、石斛、金银花的共同靶点，见Fig.4。说明YQYY方在治疗RA时为多药物、多成分起效，其作用靶点以FABP4、MMP9、PTGS2为代表。

2.5 YQYY可缓解CIA大鼠的一般状态

经过II型胶原诱导的大鼠关节炎的临床和组织学表现与人类发病情况非常相似，是研究RA的理想动物模型[10]。因此本研究借助此模型来评价YQYY方对RA的治疗作用。大鼠的饲养、药物干预及处死的时间为7周，见Fig.5A。与空白组相比，经过造模的大鼠在加强免疫后出现了不同程度的体质量下降，足爪厚度增加，关节炎指数上升，以及乏力、食欲不振等情况，在经过药物干预治疗后，以上症状均有不同程度缓解，见Fig.5B。

2.6 YQYY方可改善CIA大鼠关节症状

在各组大鼠的足爪外观展示，见Fig.6A。通过对大鼠踝关节进行CT扫描，观察各组大鼠的骨破坏，其中CIA组大鼠的骨破坏最为严重，骨皮质表面粗糙；经YQYY治疗后骨破坏程度降低；MTX联合YQYY治疗后骨破坏程度明显降低且骨皮质表面光滑，见Fig.6B。

通过对大鼠踝关节HE染色，观察各组大鼠踝关节的病理改变，CIA模型组的踝关节组织结构不清晰，胫骨、距骨均受到严重侵蚀，局部软骨层缺失，大量软骨细胞丢失，可见少量坏死组织碎片，伴有大面积血管翳，周围滑膜结缔组织重度增生；经YQYY方治疗后的胫骨、距骨只受到轻度侵蚀，血管翳呈小面积，且软骨细胞丢失量少；MTX联合YQYY治疗后的效果最好，见Fig.6C。

通过对大鼠膝关节滑膜组织HE染色，观察各组大鼠膝关节滑膜的病理改变，CIA模型组的周围滑膜结缔组织重度增生形成桥接，伴有较多的巨噬细胞、淋巴细胞浸润；经过YQYY方治疗后关节滑膜内结缔组织增生，有少量的炎性细胞浸润；效果最为突出的是MTX联合YQYY组，其病变程度最轻，滑膜未见明显增生，表面为滑膜细胞，其下为疏松结缔组织，无炎性细胞浸润，见Fig.6D。以上均提示了YQYY方对CIA大鼠的骨质有保护作用，对滑膜炎有较好的抑制作用。

2.7 YQYY可减轻CIA大鼠的炎症反应

检测各组大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β及FABP4水平，评估炎性活动状态。与空白组相比，模型组、MTX组、YQYY组、YQYY+MTX组的CRP、TNF-α、IL-1β及FABP4的水平升高，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与模型组相比，MTX组、YQYY组、YQYY+MTX组可降低大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β及FABP4的水平，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与MTX组相比，YQYY+MTX组可降低大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β及FABP4的水平，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。以上结果提示YQYY方可减轻CIA大鼠的炎症反应，YQYY联合MTX可显著减轻CIA大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β、FABP4的分泌，且疗效优于单独使用MTX，见Tab.1。表明YQYY可减轻CIA大鼠的炎症反应，并且与MTX联合使用的效果最为理想。

2.8 YQYY可通过FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路减轻CIA大鼠的炎症反应

富集分析结果提示了NF-κB信号通路，因此我们对FABP4/PPARγ/NF-κB中的几个标志物进行m RNA及蛋白分子水平的验证。经过对滑膜组织的RT-q PCR检测发现（Fig.7A），与空白组相比，CIA组的FABP4、IKKα、p65的m RNA升高（P<0.01),PPARγ的m RNA降低，但差异无统计学意义。与空白组相比，MTX组、YQYY+MTX组的FABP4、IKKα、p65的m RNA降低（P<0.05或P<0.01),PPARγ的m RNA升高（P<0.01）。与模型组相比，MTX组、YQYY组、YQYY+MTX组的FABP4、IKKα、p65的m RNA降低（P<0.01),PPARγ的m RNA升高（P<0.01）。与MTX组相比，YQYY+MTX组的FABP4、p65的m RNA降低（P<0.01),IKKα的m RNA降低，PPARγ的m RNA升高，但差异无统计学意义。以上结果提示，经过YQYY方干预能使RA大鼠的滑膜组织中FABP4、IKKα、p65的m RNA水平降低，PPARγ的m RNA水平升高，MTX+YQYY的联用效果优于单独使用MTX。另外，通过蛋白印迹可以清楚地看到在模型组中FABP4、IKKα、pp65蛋白表达增加（Fig.7B），经过YQYY方治疗能显著降低FABP4、IKKα、pp65蛋白在滑膜中的表达。蛋白变化趋势再次验证了m RNA的检测结果，NF-κB信号通路的激活被抑制，提示YQYY方很可能通过FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路减轻CIA大鼠的炎症反应。YQYY方联合MTX应用对FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路的抑制效果更为明显。

3、讨论

临床应用中YQYY是收效良好的复方，选择单独使用或联合治疗的患者人数逐渐上升，然而其抗RA的机制尚不清楚。虽然生物信息学及网络药理学研究在近几年的中医领域中应用广泛，但仍然具有一定的研究局限性，其中最主要的原因是现有的数据库收录信息不够完整，在以往的研究中通常过度依赖数据库的分析结果，在本研究中我们首先采用了生物信息学与网络药理学联合的方式对潜在的靶点及作用机制进行了预测初筛，后进行了动物实验验证。YQYY在治疗RA时，多味药物同时起效的作用靶点为FABP4、MMP9、PTGS2等。通过KEGG富集分析得到了IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等，炎症通路占据主导地位。炎症介导的关节疼痛是RA患者面临的主要问题，并且炎症反应会加重慢性免疫介导的炎症反应和骨侵蚀[11,12]，控制炎症的发生能够在一定程度上阻止免疫紊乱的发生，缓解RA的病情。

FABP4[13]是胞内脂质结合蛋白超家族FABPs成员之一，由脂肪细胞及巨噬细胞分泌，是局部和全身代谢和炎症过程的关键介质，因此是免疫代谢疾病的潜在治疗靶点。FABPs不仅在脂质结合和转运中发挥重叠的功能，而且在不同的细胞和组织中也表现出独特的特征[14]。有研究结果证实了M1极化巨噬细胞分泌的FABP4在RA的滑膜炎、血管生成和软骨退化中的重要作用[15]。MMP9为锌酶家族MMPs中的一员，与炎症之间存在特定的关系，对炎症形成及骨破坏具有保护作用[16]。PTGS2是COX2酶的编码基因，属于COX的两种异构体之一，通常情况下PTGS2的表达水平较低，在巨噬细胞经过促炎刺激后高表达[17]。PTGS2的上游受到经典的NF-κB信号通路的调控[18],PTGS2的降低能够观察到CIA大鼠关节肿胀和关节炎指数的降低，PTGS2具有抑制FLS增殖和炎症反应的功能[19]。

本研究HE染色的结果表明YQYY能改善滑膜组织中炎症细胞的浸润，滑膜组织增生，骨侵蚀程度和新生血管的产生。CRP是一种急性炎症蛋白，在体内对抗感染和炎症反应时可增加1 000倍[13]，是综合了DAS28-CRP、SDAI、美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）对RA疾病活动度评价指标的组成部分[20]，被广泛用于监测RA的全身炎症和疾病活动。TNF-α、IL-1β是RA细胞损伤和炎症的关键，同时可以低程度的受到CRP合成刺激的影响，TNF-α和IL-1β的水平与RA疾病活动密切相关[9]，同时也是NF-κB通路的下游炎性因子。根据生物信息学与网络药理学的分析结果，FABP4被确定为YQYY方治疗RA的关键靶点。因此，本研究从FABP4作为切入点，综合药物靶点和通路富集方面的结果，选用FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路进行体内实验验证，评价YQYY治疗RA的潜在机制。通过q PCR与Western blot的实验结果发现YQYY可抑制FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路减轻CIA大鼠的炎症反应，表明YQYY在一定程度上对RA具有治疗作用，MTX联合应用YQYY的治疗效果较单独应用MTX有明显优势，而且最新的研究表明临床患者体内FABP4的升高与RA的病情加重相关[21]。在体外和体内实验中，FABP4对PPAR信号通路具有激活作用，外源性FABP4能够干预脂肪细胞分化，降低PPARγ的表达，促进脂肪分解和NF-κB介导的脂肪细胞炎症反应[22]。巨噬细胞缺失FABP4后，改变细胞内的脂质组成，PPARγ的表达增加[23]，与此同时，FABP4缺陷的巨噬细胞显示IκB激酶和NF-κB活性降低，导致炎症功能的抑制，包括炎症细胞因子的产生减少[24]，另外增强活性后的PPARγ能通过泛素化和降解NF-κBp65抑制炎症，且PPARγ激动剂通过抑制IκB激酶的磷酸化来抑制NF-κB通路发挥抗炎作用[25]。下调FABP4可通过激活PPARγ抑制NF-κB信号通路，且上调的PPARγ可以降低TNF-α和IL-1β表达水平[24]，抑制IL-1β诱导的软骨细胞的炎症[26]。

此外本实验尚有不足，第一点是由于GEO数据库收入的病例与网络药理学中药活性成分和靶点信息有局限性，导致可能存在推测的结果偏倚。第二点对生物信息学和网络药理学预测的多靶点中仅进行了一个靶点通路的实验验证。第三点是由于中药方剂应用的效果差异性与各组成药物之间的用量直接相关，而本试验只进行了定性研究，未开展YQYY不同剂量与RA病情的定量研究。因此未来下一阶段可进一步开展其他靶点的验证实验，以及YQYY药物剂量与RA疾病之间剂量-疗效关系的研究。

综上，我们采用生物信息学与网络药理学联合的方式对潜在的靶点及作用机制进行了预测，得到了FABP4、MMP9、PTGS2等治疗靶点，并验证了YQYY方能改善CIA大鼠的乏力、体质量减轻、踝关节肿胀程度、滑膜炎及骨侵蚀程度，YQYY方可抑制FABP4/PPARγ/NF-κB信号通路减轻CIA大鼠的炎症反应，联合应用MTX疗效更为突出。本研究为YQYY作为复方调节炎症反应控制RA病情并对联合使用MTX疗效优于单独使用MTX治疗RA提供了实验依据。

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基金资助:高明利全国名老中医药专家传承工作室建设项目,国中医药人教函【2022】75号;辽宁省自然科学基金项目(2021-BS-180);辽宁省教育厅项目(L202041);

文章来源:关蕊,姚家树,赵夜雨等.益气养阴通络方对类风湿关节炎的作用分析及验证[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(01):26-36.