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基于显微特征颜色量化评价判别栀子与焦栀子

2024-01-22 206 上传者：管理员

摘要：目的：建立基于显微特征颜色量化评价的栀子与焦栀子判别方法。方法：采用显微成像技术和显微特征颜色提取软件测定栀子与焦栀子显微特征颜色，利用Kruska-WallisH秩和检验、Fisher判别分析法分析栀子与焦栀子显微特征颜色差异，建立判别函数。结果：栀子与焦栀子显微特征(内果皮石细胞、内果皮纤维、种皮石细胞)的亮度值(L*)、红绿色值(a*)、黄蓝色值(b*)和总色度值(Eab*)均有显著差异(P<0.01)。以种皮石细胞颜色对二者进行判别，其判别函数为y=0.678×L*+0.384×a*-0.576×b*-9.322,y>0为栀子，y<0为焦栀子。结论：通过显微特征颜色量化评价，实现了栀子与焦栀子的有效判别，为栀子生、制饮片的判别和质量评价提供了新方法。

关键词：
Fisher判别分析
显微成像技术
显微特征颜色
栀子
焦栀子
量化评价
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栀子为临床常用中药，其味苦、性寒，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功能。环烯醚萜苷类、色素类成分为栀子的主要有效成分[1,2,3]。栀子炒焦后可缓和其苦寒之性，免伤脾胃，长于凉血止血[4]。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收载了栀子和焦栀子饮片，对栀子与焦栀子饮片的显微特征颜色进行了感官描述，并规定焦栀子的显微特征颜色同栀子[5]，但缺少数字化的显微特征颜色评价标准和生、制品差异性描述。

研究表明，栀子炒焦后栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ含量显著降低，栀子苷酸含量显著升高，饮片外观颜色值也发生明显变化，栀子炒制过程中饮片外观颜色变化与其有效成分含量变化呈显著相关性[6,7,8]。有学者采用容量分析法测定栀子中种皮石细胞的显微特征常数，并证明栀子种皮石细胞的显微特征常数与栀子苷含量呈显著正相关[9]。目前尚未见到栀子与焦栀子显微特征颜色数字化评价及利用显微特征颜色量化评价对栀子与焦栀子进行判别的研究报道。本研究采用显微成像技术和显微特征颜色提取软件对栀子与焦栀子显微特征颜色进行量化评价，采用统计学方法分析二者显微特征颜色的差异性，建立栀子与焦栀子饮片的判别函数，为栀子与焦栀子饮片的质量控制提供科学依据。

1、材料与仪器

1.1 药品与试剂

1.1.1 药品

收集栀子饮片样品15批，编号为SZ1～SZ15，经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。取上述15批栀子，按《中国药典》焦栀子的炮制方法炮制[5]，得焦栀子，编号为JZ1～JZ15。按《中国药典》栀子和焦栀子饮片项下方法[5]，对栀子与焦栀子饮片样品进行性状鉴别、显微鉴别和栀子苷含量测定，结果均符合要求。样品来源信息见表1。

1.1.2 试剂

水合氯醛（分析纯，批号302-17-0，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甘油（分析纯，批号20191212，国药集团化学试剂有限公司）。水合氯醛试液的制备：按《中国药典》[10]四部所载方法，取水合氯醛50 g，加水30 m L、甘油20 m L，溶解，即得。

1.2 仪器

OLYMPUS BX 53型显微镜（广州市明美光电技术有限公司）；FA1604N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；飞船牌载玻片（25.4 mm×76.2 mm,1.0～1.2 mm，盐城市信泰医疗器械厂）；显微镜盖玻片（18 mm×18 mm,0.13～0.16 mm，江苏世泰实验器材有限公司）；101型鼓风干燥箱（常州国宇仪器制造有限公司）。

2、方法与结果

2.1 粉末装片

精密称取样品粉末（过4号筛）1 mg，置于载玻片上，滴加水合氯醛试液60µL，盖上盖玻片，置于烘箱内，90℃加热烘制10 min。

2.2 显微特征颜色测定原理

显微特征颜色提取软件以标识的显微特征图为基础，将其与图像背景区分开，并遴选待测物的显微特征，然后进行颜色测定，被测显微特征颜色分别用L*、a*、b*进行量化[11]。L*为亮度值，L*值越大表示亮度越高；a*为红绿色值，a*值越大表示颜色越红，a*越小表示颜色越绿；b*为黄蓝色值，b*值越大表示颜色越黄，b*越小表示颜色越蓝。按国际通用公式[12]计算各显微特征的总色度值E*ab，计算公式为E*ab=[L*2+a*2+b*2]1/2。为了消除显微视野背景颜色对实验数据的影响，本研究所测显微特征颜色值是扣除了背景颜色后的数据。

表1 栀子饮片来源信息

2.3 显微成像软件参数

分辨率：预览分辨率设定为2 560×1 944，捕抓分辨率为2 560×1 944。曝光控制：非自动曝光（目标120，增益1，曝光时间500 ms）。帧速为NORMAL SP。电源频率为直流。颜色控制：增益控制（红色增益75，绿色增益68，蓝色增益165）。图像调整：亮度控制（亮度：115，对比度：23，伽马值：0.730）；荧光控制为自动黑平衡（最小值24，最大值255）；图像读出模式（BINNING）为1×1。

2.4 显微镜参数

光圈设置为3，光源强度设置为3，放大倍数设置为200倍（目镜×10，物镜×20）。

2.5 精密度试验

取样品JZ1，按“2.1”项下方法装片，置显微镜下观察并摄取内果皮石细胞显微图像，用显微特征颜色提取软件测定同一内果皮石细胞的L*、a*、b*值，重复测定6次，取平均值。结果显示，上述色度值的相对标准偏差（RSD）分别为0.36%、1.11%、0.66%，符合方法学要求。

2.6 稳定性试验

取样品JZ1，按“2.1”项下方法制备装片，在室温下自然放置，分别于0、3、6、12、18、24 h置显微镜下观察并摄取同一内果皮石细胞显微图像，采用显微特征颜色提取软件测定并记录内果皮石细胞的L*、a*、b*值。结果显示，上述色度值的RSD为0.89%、1.44%、0.85%，符合方法学要求。

2.7 重复性试验

取样品JZ1，按“2.1”项下方法装片，平行6份，摄取内果皮石细胞显微图像，用显微特征颜色提取软件测定内果皮石细胞的L*、a*、b*值。结果显示，上述色度值的RSD分别为4.44%、3.92%、2.63%，符合方法学要求。

2.8 样品显微特征颜色测定

取栀子与焦栀子各15批样品，按“2.1”项下方法装片，摄取内果皮石细胞、内果皮纤维、种皮石细胞的显微图像，将显微图像导入显微特征颜色提取软件得L*、a*、b*值，重复测定3次，取平均值。结果见图1、表2。

2.9 Kruska-Wallis H秩和检验

利用SPSS 21.0软件对栀子与焦栀子内果皮石细胞、内果皮纤维和种皮石细胞的L*、a*、b*、E*ab进行统计分析，发现实验数据不符合正态分布。因此，采用Kruska-Wallis H秩和检验进行分析。结果表明，栀子与焦栀子内果皮石细胞、内果皮纤维和种皮石细胞的L*、a*、b*、E*ab均有显著差异（P<0.01），说明栀子炒焦后显微特征颜色发生显著变化。栀子与焦栀子E*ab差值（栀子E*ab-焦栀子E*ab）排列顺序为：种皮石细胞（18.40）>内果皮纤维（15.63）>内果皮石细胞（15.60），栀子与焦栀子种皮石细胞的E*ab差异最大。见表3、表4、表5。

图1 栀子（A）与焦栀子（B）显微特征图（200×）

表2 栀子与焦栀子显微特征颜色测定结果（n=3)

2.1 0 Fisher判别分析

选取栀子与焦栀子显微特征差值最大的种皮石细胞作为其差异性显微特征，以种皮石细胞的L*、a*、b*、为自变量进行Fisher判别分析。a*的P值为0.005,L*、b*、值的P值均小于0.001，说明L*、a*、b*、对栀子与焦栀子的判别均具有统计学意义。

以种皮石细胞的实测数据L*、a*、b*为自变量建立非标准化典型判别函数y=0.678×L*+0.384×a*-0.576×b*-9.322，该函数判别规则为：y>0判为栀子，y<0判为焦栀子。用所测样本数据对判别式作回代考核，检验判别式的可靠性。结果表明，建立的判别函数对栀子与焦栀子的正判率均为100%。见表6。

表3 栀子与焦栀子内果皮石细胞显微特征颜色量化值比较（±s)

表4 栀子与焦栀子内果皮纤维显微特征颜色量化值比较（±s)

表5 栀子与焦栀子种皮石细胞显微特征颜色量化值比较（±s)

表6 栀子与焦栀子种皮石细胞颜色判别函数回代检验结果

3、讨论

《中国药典》收载的中药显微鉴别粉末制片法有冷法装片法和酒精灯加热透化装片法，上述方法均为手动操作，缺少客观的工艺技术参数，成品透化质量凭个人经验掌握，致使透化程度不稳定，进而影响显微特征颜色测定的准确性。本研究采用烘箱加热透化工艺制片，保证了成品透化质量的稳定，且操作简便，便于控制。

中药饮片外观、粉末及显微特征的颜色是其质量评价的重要内容，与中药品质关系密切[13]。目前，《中国药典》对中药饮片的显微鉴别大多只对显微特征的直径、长度有量化规定，而对显微特征颜色等其他特征均为感官观察、主观描述，缺乏客观的量化方法，难以评判中药饮片质量的优劣。有学者建立了容量分析法测定中药锦灯笼果实、茯苓、吴茱萸显微特征指数的方法，并证明显微特征指数与中药有效成分含量具有相关性[14,15,16]。本研究采用显微成像技术摄取栀子与焦栀子饮片的显微特征图像，利用显微特征颜色提取软件实现显微特征的分割和颜色测定。结果表明，该方法准确、简便、快速，可用于栀子与焦栀子饮片的质量控制。

本研究发现，栀子炒焦后内果皮石细胞、内果皮纤维、种皮石细胞的L*、b*、E*ab显著降低，a*显著升高，说明栀子炒焦后其显微特征颜色值发生了显著变化。本实验以栀子和焦栀子显微特征E*ab差值最大者种皮石细胞作为栀子与焦栀子主要差异性显微特征，以栀子与焦栀子种皮石细胞的L*、a*、b*为依据，利用Fisher判别分析建立栀子与焦栀子显微特征颜色的判别函数，实现了栀子与焦栀子的快速判别。

本研究建立的栀子与焦栀子显微特征颜色数字化评价和快速判别方法，为提升栀子与焦栀子饮片质量标准提供了科学依据，为中药生、制饮片的判别提供了一种新方法。但栀子炒焦后显微特征颜色变化与内在有效成分含量变化的相关性尚不清楚，课题组未来将深入研究栀子炒制过程中显微特征颜色变化与成分含量变化的相关性，探索建立具有生、制品个性特点的栀子不同饮片显微特征颜色评价标准。

参考文献:

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基金资助:国家重点研发计划项目(编号:2018YFC1707204,2018YFC1707002) 山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心资助项目(编号:CYLXTCX2021-12);国家中医药管理局中药炮制技术传承地项目(批文号:国中医药科技中药[2022]59号);山东省中医药科技发展计划项目(编号:2019-0955);

文章来源:王玲,张学兰,李慧芬等.基于显微特征颜色量化评价判别栀子与焦栀子[J].山东中医药大学学报,2024,48(01):100-105.