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小檗胺对糖尿病肾小管上皮细胞损伤的影响

2024-02-09 100 上传者：管理员

摘要：目的研究小檗胺对体外糖尿病肾小管上皮细胞(RTEC)损伤的影响。方法将RTEC分成对照组、模型组(高糖)、低剂量实验组(2 mg·L-1小檗胺和高糖)、中剂量实验组(4 mg·L-1小檗胺和高糖)、高剂量实验组(8 mg·L-1小檗胺和高糖)、BBM-H+miR-NC组(转染mimics control, 8 mg·L-1小檗胺和高糖)、BBM-H+miR-135b组(转染miR-135b mimics, 8 mg·L-1小檗胺和高糖)。以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性，以流式细胞术检测细胞凋亡率，以蛋白质印迹法检测细胞B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达，以化学荧光法检测活性氧(ROS)水平，以硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平，以黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果对照组、模型组和低、中、高剂量实验组的RTEC增殖活性(OD值)分别为0.66±0.04、0.36±0.02、0.43±0.03、0.54±0.03和0.63±0.05,细胞凋亡率分别为(3.62±0.31)%、(29.41±2.33)%、(20.10±1.65)%、(15.02±1.25)%和(9.58±1.43)%,MDA分别为(1.04±0.12)、(5.24±0.29)、(3.45±0.22)、(2.16±0.13)和(1.60±0.11)nmol·mL-1,SOD分别为(240.22±12.06)、(130.56±10.84)、(169.62±12.50)、(201.97±12.78)和(236.74±14.52)U·mL-1,TNF-α分别为(31.25±2.51)、(51.84±4.20)、(44.52±2.61)、(38.25±1.50)和(32.10±1.78)mg·L-1,IL-8分别为(10.59±1.14)、(19.95±1.74)、(16.10±1.03)、(13.52±1.25)和(11.17±0.92)mg·L-1,IL-1β分别为(23.01±1.45)、(56.92±2.51)、(43.20±1.96)、(32.05±1.23)和(26.37±2.48)mg·L-1。模型组的上述指标与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);BBM-H+miR-NC组与BBM-H+miR-135b组的上述指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论小檗胺通过下调miR-135b减少体外糖尿病RTEC损伤。

关键词：
RTEC
RTEC损伤
小檗胺
糖尿病
肾小管上皮细胞
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糖尿病肾病是一种常见的糖尿病并发症，也是终末期肾病发生的主要因素。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells, RTEC)损伤被认为是糖尿病肾病发生的关键原因之一。研究显示，在高血糖条件下，RTEC氧化损伤，产生大量的炎症因子，诱导细胞过度凋亡，导致肾组织正常功能被破坏，最终导致糖尿病肾组织损伤[1]。小檗胺是一种双苄基异喹啉类生物碱，提取自中草药黄芦木，具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤等多种药理学作用。小檗胺可显著减轻糖尿病肾病大鼠肾组织损伤程度，降低肾组织炎症因子水平[2]。miR-135b是人体组织中具有广泛生物学作用的调节因子，其在糖尿病肾病中表达上调，可促进高糖诱导的RTEC凋亡，加重细胞损伤[3]。本研究通过构建体外糖尿病RTEC模型，旨在探究小檗胺对RTEC损伤的作用及机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞RTEC HK-2,购自美国ATCC细胞库。

药品与试剂小檗胺，规格：每瓶10 mg,批号：20211106,购自成都乐美天医药科技有限公司。活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒，购自北京杰辉博高生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-1β(interleukin1β,IL-1β)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bcl-associated X protein, Bax)抗体，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒，购自青岛克斯特生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒，购自上海创赛科技有限公司。

2 实验方法

2.1 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测小檗胺对RTEC增殖活性[4]4]

将RTEC种植到96孔板内，细胞培养过夜后，分别在细胞中添加含有小檗胺终浓度为0、2、4、8、16、32 mg·L-1的细胞培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，将培养板取出，分别添加MTT溶液10μL,继续培养4 h,然后将孔中的液体吸弃，添加二甲基亚砜溶液150μL,室温、避光孵育10 min,然后用酶标仪检测490 nm的光密度(optical density, OD)值，OD值代表细胞增殖活性。

2.2 细胞分组与处置方法

RTEC在实验开始前12 h,用不含血清的细胞培养液同步化，将细胞分成5组，分别为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，对照组细胞用含有5.5 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，同时低、中、高剂量实验组细胞中分别添加2、4、8 mg·L-1的小檗胺，各组细胞培养24 h以后，按照MTT方法检测细胞增殖活性变化，步骤参照“2.1”。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率[5]5]

收集对照组、模型组和低、中、高剂量实验组细胞，分别将细胞悬浮在冰预冷的磷酸盐缓冲液中，以1 000×g离心10 min,弃掉上清液，然后添加结合缓冲液500μL,继续加入PI 5μL和Annexin V-FITC 5μL,充分混合，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 蛋白质印迹(Western blotting)法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达水平

收集各组细胞，分别在细胞中添加裂解液，放在冰上充分裂解30 min,然后转移到新的离心管中，4℃条件下以1.2×104×g离心10 min,吸去上清液，用二喹啉甲酸法测定浓度后，加入等体积的2×Loading Buffer溶液，100℃煮沸5 min。按照文献[6]的方法操作，根据电化学发光试剂盒发光，结果用Image J软件分析条带的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为参照。

2.5 ROS、MDA、SOD水平检测[7]7]

收集各组细胞，用ROS检测试剂盒(化学荧光法)、MDA检测试剂盒(硫代巴比妥酸法)、SOD检测试剂盒(黄嘌呤氧化法)检测ROS、MDA、SOD水平，ROS结果以相对荧光强度表示。

2.6 ELISA法检测TNF-α、IL-8、IL-1β水平[8]8]

收集各组细胞培养液上清液，按照TNF-α、IL-8、IL-1βELISA检测试剂盒说明书操作步骤，检测各组细胞培养液上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β含量。

2.7 定量反转录聚合酶链反应法检测miR-135b的表达水平

收集各组细胞，在细胞中加入Trizol试剂，提取细胞RNA。根据miR-X miRNA First-Strand Synthesis Kit合成cDNA。参照文献[9]方法操作，结果以U6作为参照，分析miR-135b表达变化(2-△△Ct法)。

2.8 检测miR-135b mimics对小檗胺影响糖尿病RTEC的作用

在RTEC中转染mimics control、miR-135b mimics,然后给予30 mmol·L-1葡萄糖和8 mg·L-1小檗胺细胞培养液处理培养，分别命名为BBM-H+miR-NC组、BBM-H+miR-135b组。细胞转染方法按照Lipofectamine 2000说明书进行。BBM-H+miR-NC组、BBM-H+miR-135b组细胞培养24 h后，按照上述步骤分别检测miR-135b表达，细胞增殖活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表达以及TNF-α、IL-8、IL-1β水平。

3 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 小檗胺对RTEC增殖活性(OD值)影响

0、2、4、8、16、32 mg·L-1小檗胺处理后的RTEC增殖活性分别为0.65±0.05、0.64±0.07、0.62±0.06、0.60±0.08、0.46±0.05和0.35±0.06,与0 mg·L-1小檗胺处理后的RTEC增殖活性比较，2、4、8 mg·L-1小檗胺处理后细胞增殖活性没有变化，16、32 mg·L-1小檗胺处理后细胞增殖活性均明显降低(均P<0.05)。因此，选择对RTEC增殖活性没有影响的2、4、8 mg·L-1小檗胺进行后续研究。

2 小檗胺对糖尿病RTEC增殖活性和凋亡率的影响

模型组在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，对照组细胞用含有5.5 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，低、中、高剂量实验组在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，添加2、4、8 mg·L-1小檗胺。

与对照组相比，模型组RTEC增殖活性和Bcl-2蛋白表达均明显降低，细胞凋亡率和Bax蛋白表达均明显升高(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组RTEC增殖活性和Bcl-2蛋白表达依次升高，细胞凋亡率和Bax蛋白表达依次降低(均P<0.05),见表1。

3 小檗胺对糖尿病RTEC氧化损伤的影响

与对照组相比，模型组RTEC的ROS和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组RTEC的ROS和MDA水平依次下降，SOD水平依次升高(均P<0.05),见表2。

4 小檗胺对糖尿病RTEC分泌炎症因子影响

与对照组比，模型组RTEC上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比，低、中、高剂量实验组RTEC上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β水平均依次下降(均P<0.05),见表3。

5 小檗胺对糖尿病RTEC中miR-135b表达影响

对照组、模型组和低、中、高剂量试验组RTEC中miR-135b表达水平分别为1.00±0.11、2.78±0.15、2.26±0.18、1.69±0.13和1.28±0.16;与对照组相比，模型组的miR-135b表达水平显著升高(P<0.05),与模型组相比，低、中、高剂量实验组miR-135b表达水平依次下降(均P<0.05)。小檗胺下调糖尿病RTEC中miR-135b表达水平。

6 上调miR-135b对小檗胺影响糖尿病RTEC损伤的作用

与BBM-H+miR-NC组比较，BBM-H+miR-135b组RTEC中miR-135b表达水平、细胞凋亡率和Bax蛋白表达均显著升高，细胞增殖活性和Bcl-2蛋白表达均显著降低，ROS和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低，TNF-α、IL-8、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05),见表4。

表1小檗胺处理后糖尿病RTEC增殖活性、凋亡率和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平的比较

表2小檗胺处理后糖尿病RTEC的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平比较

表3小檗胺处理后糖尿病RTEC上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平的比较

表4 miR-135 mimics转染后小檗胺处理的糖尿病RTEC增殖活性、凋亡率、ROS水平、MDA水平、SOD水平和Bax、Bcl-2蛋白表达水平以及TNF-α、IL-8、IL-1β水平的比较

三、讨论

本研究中，高糖刺激后的RTEC增殖活性降低，细胞凋亡水平增加，ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，TNF-α、IL-8、IL-1β增加，说明高糖可诱导RTEC损伤，体外糖尿病RTEC损伤模型已成功构建。

小檗胺具有升高白细胞、改善心律失常、抑制肿瘤生长等药理学作用[10]。小檗胺对肾组织损伤也有治疗功效，小檗胺治疗后的肾缺血再灌注大鼠肾组织中ROS水平降低[11]。小檗胺抑制糖尿病肾病大鼠肾组织炎症，减轻肾组织损伤，避免肾组织细胞凋亡[12]。本研究中，经小檗胺处理后，体外糖尿病RTEC各观察指标均显著改善，提示小檗胺减少体外糖尿病RTEC凋亡，抑制炎症因子分泌和氧化损伤，改善体外糖尿病RTEC损伤。

本研究中，高糖条件下RTEC中miR-135b高表达，而小檗胺可降低细胞miR-135b表达水平，提示小檗胺的作用机制可能与miR-135b有关。逆转实验进一步验证小檗胺的作用机制，结果发现，上调miR-135b逆转了小檗胺对高糖条件下RTEC增殖、凋亡、炎症因子分泌和氧化损伤影响，进一步验证了小檗胺通过下调miR-135b改善体外糖尿病RTEC损伤。

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基金资助:山西省基础研究计划基金资助项目(202303021211107);

文章来源:张鹏飞,布琼星,衡艳艳等.小檗胺对糖尿病肾小管上皮细胞损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):358-362.