首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 中医医学论文 > 中药治疗论文 > 小檗胺对糖尿病肾小管上皮细胞损伤的影响

小檗胺对糖尿病肾小管上皮细胞损伤的影响

2024-02-09 101 上传者：管理员

摘要：目的研究小檗胺对体外糖尿病肾小管上皮细胞(RTEC)损伤的影响。方法将RTEC分成对照组、模型组(高糖)、低剂量实验组(2 mg·L-1小檗胺和高糖)、中剂量实验组(4 mg·L-1小檗胺和高糖)、高剂量实验组(8 mg·L-1小檗胺和高糖)、BBM-H+miR-NC组(转染mimics control, 8 mg·L-1小檗胺和高糖)、BBM-H+miR-135b组(转染miR-135b mimics, 8 mg·L-1小檗胺和高糖)。以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性，以流式细胞术检测细胞凋亡率，以蛋白质印迹法检测细胞B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达，以化学荧光法检测活性氧(ROS)水平，以硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平，以黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果对照组、模型组和低、中、高剂量实验组的RTEC增殖活性(OD值)分别为0.66±0.04、0.36±0.02、0.43±0.03、0.54±0.03和0.63±0.05,细胞凋亡率分别为(3.62±0.31)%、(29.41±2.33)%、(20.10±1.65)%、(15.02±1.25)%和(9.58±1.43)%,MDA分别为(1.04±0.12)、(5.24±0.29)、(3.45±0.22)、(2.16±0.13)和(1.60±0.11)nmol·mL-1,SOD分别为(240.22±12.06)、(130.56±10.84)、(169.62±12.50)、(201.97±12.78)和(236.74±14.52)U·mL-1,TNF-α分别为(31.25±2.51)、(51.84±4.20)、(44.52±2.61)、(38.25±1.50)和(32.10±1.78)mg·L-1,IL-8分别为(10.59±1.14)、(19.95±1.74)、(16.10±1.03)、(13.52±1.25)和(11.17±0.92)mg·L-1,IL-1β分别为(23.01±1.45)、(56.92±2.51)、(43.20±1.96)、(32.05±1.23)和(26.37±2.48)mg·L-1。模型组的上述指标与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);BBM-H+miR-NC组与BBM-H+miR-135b组的上述指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论小檗胺通过下调miR-135b减少体外糖尿病RTEC损伤。

关键词：
RTEC
RTEC损伤
小檗胺
糖尿病
肾小管上皮细胞
加入收藏

糖尿病肾病是一种常见的糖尿病并发症，也是终末期肾病发生的主要因素。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells, RTEC)损伤被认为是糖尿病肾病发生的关键原因之一。研究显示，在高血糖条件下，RTEC氧化损伤，产生大量的炎症因子，诱导细胞过度凋亡，导致肾组织正常功能被破坏，最终导致糖尿病肾组织损伤[1]。小檗胺是一种双苄基异喹啉类生物碱，提取自中草药黄芦木，具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤等多种药理学作用。小檗胺可显著减轻糖尿病肾病大鼠肾组织损伤程度，降低肾组织炎症因子水平[2]。miR-135b是人体组织中具有广泛生物学作用的调节因子，其在糖尿病肾病中表达上调，可促进高糖诱导的RTEC凋亡，加重细胞损伤[3]。本研究通过构建体外糖尿病RTEC模型，旨在探究小檗胺对RTEC损伤的作用及机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞RTEC HK-2,购自美国ATCC细胞库。

药品与试剂小檗胺，规格：每瓶10 mg,批号：20211106,购自成都乐美天医药科技有限公司。活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒，购自北京杰辉博高生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-1β(interleukin1β,IL-1β)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bcl-associated X protein, Bax)抗体，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒，购自青岛克斯特生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒，购自上海创赛科技有限公司。

2 实验方法

2.1 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测小檗胺对RTEC增殖活性[4]4]

将RTEC种植到96孔板内，细胞培养过夜后，分别在细胞中添加含有小檗胺终浓度为0、2、4、8、16、32 mg·L-1的细胞培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，将培养板取出，分别添加MTT溶液10μL,继续培养4 h,然后将孔中的液体吸弃，添加二甲基亚砜溶液150μL,室温、避光孵育10 min,然后用酶标仪检测490 nm的光密度(optical density, OD)值，OD值代表细胞增殖活性。

2.2 细胞分组与处置方法

RTEC在实验开始前12 h,用不含血清的细胞培养液同步化，将细胞分成5组，分别为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，对照组细胞用含有5.5 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，同时低、中、高剂量实验组细胞中分别添加2、4、8 mg·L-1的小檗胺，各组细胞培养24 h以后，按照MTT方法检测细胞增殖活性变化，步骤参照“2.1”。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率[5]5]

收集对照组、模型组和低、中、高剂量实验组细胞，分别将细胞悬浮在冰预冷的磷酸盐缓冲液中，以1 000×g离心10 min,弃掉上清液，然后添加结合缓冲液500μL,继续加入PI 5μL和Annexin V-FITC 5μL,充分混合，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 蛋白质印迹(Western blotting)法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达水平

收集各组细胞，分别在细胞中添加裂解液，放在冰上充分裂解30 min,然后转移到新的离心管中，4℃条件下以1.2×104×g离心10 min,吸去上清液，用二喹啉甲酸法测定浓度后，加入等体积的2×Loading Buffer溶液，100℃煮沸5 min。按照文献[6]的方法操作，根据电化学发光试剂盒发光，结果用Image J软件分析条带的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为参照。

2.5 ROS、MDA、SOD水平检测[7]7]

收集各组细胞，用ROS检测试剂盒(化学荧光法)、MDA检测试剂盒(硫代巴比妥酸法)、SOD检测试剂盒(黄嘌呤氧化法)检测ROS、MDA、SOD水平，ROS结果以相对荧光强度表示。

2.6 ELISA法检测TNF-α、IL-8、IL-1β水平[8]8]

收集各组细胞培养液上清液，按照TNF-α、IL-8、IL-1βELISA检测试剂盒说明书操作步骤，检测各组细胞培养液上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β含量。

2.7 定量反转录聚合酶链反应法检测miR-135b的表达水平

收集各组细胞，在细胞中加入Trizol试剂，提取细胞RNA。根据miR-X miRNA First-Strand Synthesis Kit合成cDNA。参照文献[9]方法操作，结果以U6作为参照，分析miR-135b表达变化(2-△△Ct法)。

2.8 检测miR-135b mimics对小檗胺影响糖尿病RTEC的作用

在RTEC中转染mimics control、miR-135b mimics,然后给予30 mmol·L-1葡萄糖和8 mg·L-1小檗胺细胞培养液处理培养，分别命名为BBM-H+miR-NC组、BBM-H+miR-135b组。细胞转染方法按照Lipofectamine 2000说明书进行。BBM-H+miR-NC组、BBM-H+miR-135b组细胞培养24 h后，按照上述步骤分别检测miR-135b表达，细胞增殖活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表达以及TNF-α、IL-8、IL-1β水平。

3 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 小檗胺对RTEC增殖活性(OD值)影响

0、2、4、8、16、32 mg·L-1小檗胺处理后的RTEC增殖活性分别为0.65±0.05、0.64±0.07、0.62±0.06、0.60±0.08、0.46±0.05和0.35±0.06,与0 mg·L-1小檗胺处理后的RTEC增殖活性比较，2、4、8 mg·L-1小檗胺处理后细胞增殖活性没有变化，16、32 mg·L-1小檗胺处理后细胞增殖活性均明显降低(均P<0.05)。因此，选择对RTEC增殖活性没有影响的2、4、8 mg·L-1小檗胺进行后续研究。

2 小檗胺对糖尿病RTEC增殖活性和凋亡率的影响

模型组在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，对照组细胞用含有5.5 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，低、中、高剂量实验组在实验开始时用含有30 mmol·L-1葡萄糖的细胞培养液处理，添加2、4、8 mg·L-1小檗胺。

与对照组相比，模型组RTEC增殖活性和Bcl-2蛋白表达均明显降低，细胞凋亡率和Bax蛋白表达均明显升高(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组RTEC增殖活性和Bcl-2蛋白表达依次升高，细胞凋亡率和Bax蛋白表达依次降低(均P<0.05),见表1。

3 小檗胺对糖尿病RTEC氧化损伤的影响

与对照组相比，模型组RTEC的ROS和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组RTEC的ROS和MDA水平依次下降，SOD水平依次升高(均P<0.05),见表2。

4 小檗胺对糖尿病RTEC分泌炎症因子影响

与对照组比，模型组RTEC上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比，低、中、高剂量实验组RTEC上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β水平均依次下降(均P<0.05),见表3。

5 小檗胺对糖尿病RTEC中miR-135b表达影响

对照组、模型组和低、中、高剂量试验组RTEC中miR-135b表达水平分别为1.00±0.11、2.78±0.15、2.26±0.18、1.69±0.13和1.28±0.16;与对照组相比，模型组的miR-135b表达水平显著升高(P<0.05),与模型组相比，低、中、高剂量实验组miR-135b表达水平依次下降(均P<0.05)。小檗胺下调糖尿病RTEC中miR-135b表达水平。

6 上调miR-135b对小檗胺影响糖尿病RTEC损伤的作用

与BBM-H+miR-NC组比较，BBM-H+miR-135b组RTEC中miR-135b表达水平、细胞凋亡率和Bax蛋白表达均显著升高，细胞增殖活性和Bcl-2蛋白表达均显著降低，ROS和MDA水平均显著升高，SOD水平显著降低，TNF-α、IL-8、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05),见表4。

表1小檗胺处理后糖尿病RTEC增殖活性、凋亡率和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平的比较

表2小檗胺处理后糖尿病RTEC的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平比较

表3小檗胺处理后糖尿病RTEC上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平的比较

表4 miR-135 mimics转染后小檗胺处理的糖尿病RTEC增殖活性、凋亡率、ROS水平、MDA水平、SOD水平和Bax、Bcl-2蛋白表达水平以及TNF-α、IL-8、IL-1β水平的比较

三、讨论

本研究中，高糖刺激后的RTEC增殖活性降低，细胞凋亡水平增加，ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，TNF-α、IL-8、IL-1β增加，说明高糖可诱导RTEC损伤，体外糖尿病RTEC损伤模型已成功构建。

小檗胺具有升高白细胞、改善心律失常、抑制肿瘤生长等药理学作用[10]。小檗胺对肾组织损伤也有治疗功效，小檗胺治疗后的肾缺血再灌注大鼠肾组织中ROS水平降低[11]。小檗胺抑制糖尿病肾病大鼠肾组织炎症，减轻肾组织损伤，避免肾组织细胞凋亡[12]。本研究中，经小檗胺处理后，体外糖尿病RTEC各观察指标均显著改善，提示小檗胺减少体外糖尿病RTEC凋亡，抑制炎症因子分泌和氧化损伤，改善体外糖尿病RTEC损伤。

本研究中，高糖条件下RTEC中miR-135b高表达，而小檗胺可降低细胞miR-135b表达水平，提示小檗胺的作用机制可能与miR-135b有关。逆转实验进一步验证小檗胺的作用机制，结果发现，上调miR-135b逆转了小檗胺对高糖条件下RTEC增殖、凋亡、炎症因子分泌和氧化损伤影响，进一步验证了小檗胺通过下调miR-135b改善体外糖尿病RTEC损伤。

参考文献:

[1]戚畅,祝高红,丁娟娟.人参皂苷通过调控miR-654对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(14):1612-1617.

[2]石磊,向海燕,朱玲华.小檗胺对糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎性细胞因子产生的影响[J].免疫学杂志,2020,36(7):599-605.

[4]黄玉成,许慧,陈晓昱,等.隐丹参酮对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制､凋亡的促进和TGF-β1/Smads信号通路活性的下调[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2022,31(4):351-358.

[5]肖磊,杨志雄,赖微微,等.circ_0026344靶向miR-938调控肺癌A549细胞迁移､侵袭及凋亡的分子机制研究[J].中国免疫学杂志,2023,39(2):354-358.

[6]赵学梅,张奇,王明,等.脱氢表雄酮对血管性痴呆小鼠大脑皮层神经元凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(6):839-842.

[7]蒋炜,孙奥琪,李轩,等.三七总皂苷对同型半胱氨酸损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中国药师,2019,22(7):1197-1200.

[8]郭伟胜,付利然,张娟,等.过表达SIRT1通过上调幽门螺杆菌感染的胃癌细胞自噬通量以促进其凋亡并抑制炎症因子释放[J].中国免疫学杂志,2023,39(1):116-122,130.

[9]陈士伟,杨美菊,李倩,等.微小RNA-135a调控骨肉瘤细胞的增殖､迁移和凋亡[J].中华实验外科杂志,2022,39(11):2101-2104.

[11]邬凌峰,陈斌,汪雪萍,等.盐酸小檗碱对大鼠肾缺血再灌注的保护作用及机制研究[J].全科医学临床与教育,2019,17(5):413-417.

基金资助:山西省基础研究计划基金资助项目(202303021211107);

文章来源:张鹏飞,布琼星,衡艳艳等.小檗胺对糖尿病肾小管上皮细胞损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):358-362.