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瓜蒌提取物对缺血性心肌病大鼠心肌纤维化改善作用的实验研究

2024-03-18 104 上传者：管理员

摘要：目的:观察瓜蒌提取物对缺血性心肌病(ICM)大鼠心肌纤维化的改善作用，并探讨其作用机制。方法:SD大鼠36只，随机分成正常对照组、模型组、瓜蒌提取物组，每组12只。腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)制备大鼠ICM模型，瓜蒌提取物组灌胃瓜蒌提取物溶液4 g/kg,正常对照组和模型组灌胃相同剂量生理盐水，给药4周，ELISA法检测血清心肌纤维化指标[转化生长因子(TGF)-1β、结缔组织生长因子(CTGF)、半乳糖凝集素(Gal)-3],化学发光法检测氧化应激指标[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)],ELISA法检测炎性因子[白细胞介素(IL)-6,肿瘤、坏死因子(TNF)-α,C反应蛋白(CRP)]。光镜观察各组大鼠心肌组织病理变化。结果:模型组血清TGF-1β、CTGF、Gal-3水平均高于正常组，瓜蒌提取物组TGF-1β、CTGF、Gal-3水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组血清SOD活性低于正常组，MDA含量高于正常组；瓜蒌提取物组SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组血清TNF-α、IL-6、CRP水平高于正常组，瓜蒌提取物组TNF-α、IL-6、CRP水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。Masson染色显示，正常组大鼠心肌组织血管周围见少量均匀分布的胶原纤维。模型组大鼠心肌组织可见大量胶原纤维，且深入组织间隙，分布不均匀，形态杂乱。瓜蒌提取物组心肌组织形态基本正常。结论:瓜蒌提取物能够减轻ICM大鼠心肌纤维化程度，其作用与抗氧化、抗炎作用有关。

关键词：
心肌纤维化
氧化应激
炎症反应
瓜蒌提取物
缺血性心肌病
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缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy, ICM)是冠心病的一种特殊类型或晚期阶段，病理表现为心肌缺血性坏死，继发组织纤维增生，从而导致心肌纤维化[1]。现有治疗药物能够减少ICM患者心血管意外，减轻症状发作程度，但无法逆转心肌纤维化进程[2];因此，临床亟需探索治疗ICM的特效药物，延缓心肌纤维化进展，实现ICM病情的有效控制。瓜蒌皮为葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥成熟果皮，具有清热化痰、理气宽胸作用，是目前临床比较常用的中草药[3]。前期研究成果证实瓜蒌皮改善心肌缺血疗效满意[4]。另有研究显示，瓜蒌皮提取物能够提高心肌细胞存活率，发挥心肌保护作用，延缓心肌缺血进程[5]。本实验观察了瓜蒌皮提取物对ICM大鼠心肌纤维化的干预效果，并探讨其有关作用机制，为ICM治疗药物的探索积累循证数据。

1、材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性成年SD大鼠36 只，体质量250～280 g, 上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。饲养条件：室温22～24 ℃,湿度50%～60%,12 h交替照明，自由进食。适应性喂养1 周。实验过程严格遵守科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》,并获得医院动物伦理委员会批准，按照3R原则给予实验动物人道关怀。

1.2 实验药物

瓜蒌皮药材购自同仁堂，经鉴定为葫芦科植物栝楼的干燥成熟果皮。瓜蒌皮提取物的制备：称取100 g干燥瓜蒌皮，加水1 000 mL浸泡30 min, 小火煎煮2 h, 8 层纱布过滤，以同样方法重复提取滤渣2 次，过滤，最终将滤液合并，浓缩至100 mL。将浓缩滤液经真空冷冻干燥，即获得瓜蒌皮提取物，保存于4℃环境下备用。临用时以DMEM高糖培养基溶解制成20 g/L的贮备液。

1.3 主要实验试剂和仪器

TGF-1β、CTGF、Gal-3、IL-6、TNF-α、CRP ELISA检测试剂盒：赛默飞世尔科技有限公司；SOD、 MDA检测试剂盒：赛默飞世尔科技有限公司。;Masson三色染色试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司。TGL16医用离心机：长沙英泰仪器有限公司；VisualSonics 2100小动物彩色超声影像系统：广州隆泽生物科技有限公司；SpectraMax ABS 全波长酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司；CKX23 显微镜：Olympus。

1.4 动物分组、造模及给药

36 只大鼠随机分为正常对照组、模型组与瓜蒌提取物组，每组12只。ICM大鼠模型的制备方法[6]:20%氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切开颈部皮肤并分离气管，行气管插管并连接呼吸机，设置呼吸频率60 beats/min, 呼吸比率3∶1,通气量1 mL/g。沿胸骨左缘第二、三肋间隙迅速打开胸腔及心包，暴露心脏，采用0/3号缝合线从左心耳下缘1 mm处进针，于肺动脉圆锥左缘出针。完成后将心脏复位，结扎冠状动脉前降支，关闭胸腔，观察心电图变化。以肢体标准Ⅱ 导连接BL420生理仪记录大鼠心电图，以心电图显示ST段抬高，T波高尖视为建模成功。瓜蒌提取物组予瓜蒌提取物溶液(4 g/kg)灌胃，正常对照组和模型组灌胃相同剂量生理盐水，每日1 次，连续给药4 周。

1.5 观察指标

1.5.1 血清心肌纤维化指标、氧化应激指标及炎症因子检测

末次给药后，禁食不禁水12 h, 采集腹主动脉血1.0～1.5 mL,以3 500 r/min离心10 min, 离心半径8 cm取上清；ELISA法检测心肌纤维化指标TGF-1β、CTGF、Gal-3;化学发光法检测氧化应激指标SOD、MDA;ELISA法检测炎性因子IL-6、TNF-α、CRP。

1.5.2 心肌病理学观察

末次给药后，禁食不禁水12 h, 超声引导下腹腔注射5%水合氯醛溶液，麻醉后开胸取出心脏，无菌生理盐水清洗残留血液，取左心室组织，4%多聚甲醛溶液固定，包埋、脱水，5 μm石蜡切片，行Masson染色，封片后随机挑选5个视野，镜下观察心肌组织纤维化程度。

1.6 统计学方法

SPSS25.0软件处理实验数据，使用Shapiro-Wilk检验计量资料，服从正态分布的数据用表示，多组间比较行单因素方差检验，两两比较行LSD检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 3 组大鼠血清心肌纤维化指标比较

见表1。

表1 3组大鼠血清心肌纤维化指标比较

2.2 3 组大鼠血清氧化应激指标比较

见表2。

表2 3组大鼠血清氧化应激指标比较

2.3 3 组大鼠血清炎性因子检测结果比较

见表3。

表3 3组大鼠血清炎性因子水平比较

2.4 3 组大鼠心肌组织病理学变化

Masson染色显示：正常组大鼠心肌组织血管周围见少量均匀分布的胶原纤维。模型组大鼠心肌组织可见大量胶原纤维，且深入组织间隙，分布不均匀，形态杂乱。瓜蒌提取物组心肌组织形态基本正常。见图1。

图1 3 组大鼠心肌组织病理变化(Masson, ×400)

3、讨论

瓜蒌是中医治疗心肌缺血的经典药材，历史悠久，且适用范围广泛，在诸多心脏疾病的治疗中获得满意疗效[7,8]。瓜蒌皮富含黄酮、多糖、氨基酸、蛋白质等多种化学成分，具有抗动脉粥样硬化、扩张冠状动脉、保护内皮功能等作用[9]。瓜蒌皮提取物通过减少内皮素-1释放，促进冠状动脉扩张的途径提高心肌血流灌注，还能够通过抗血小板聚集预防血管狭窄，降低血栓形成风险，达到改善心肌缺血的目的[10]。

既往研究证明，瓜蒌皮传统水煎液、水提物能够抑制心肌缺血大鼠ST段升高，减小心肌梗死面积，抑制心肌酶活性，而瓜蒌皮醇提物没有上述作用[11]。本研究结果显示瓜蒌提取物组TGF-1β、CTGF、Gal-3水平得到改善，心肌组织光镜观察显示心肌组织形态基本恢复正常。说明瓜蒌提取物能够减轻ICM大鼠心肌纤维化程度。

氧化应激是导致心肌细胞凋亡的机制之一，心肌细胞在缺氧环境下往往发生氧化应激损伤，大量活性氧自由基释放导致中性粒细胞浸润，蛋白酶过度分泌，对细胞内核酸、蛋白等物质造成破坏，这一过程导致大量氧化物释放，损害心肌细胞，最终导致心肌纤维化[12];因此，抗氧化治疗在抗ICM心肌纤维化中占据重要地位。SOD作为广泛存在体内的内源性抗氧化酶，有抗氧化、抗衰老作用，SOD活性能够直接反映机体抗氧化能力，间接提示氧化应激程度；MDA是活性氧攻击细胞产生的一种氧化产物，能够直接体现细胞受活性氧损伤程度，从而反映机体氧化应激程度[13,14]。本研究中，瓜蒌提取物组血清SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组；表明瓜蒌提取物改善ICM心肌纤维化与抗氧化机制有关。

早在1990年Leslie等[15]首次提出，炎症因子与左心室纤维化有关，随着炎症反应的扩大，大量淋巴细胞浸润心肌组织，导致心肌损伤发生。目前，炎症被认为是导致心肌纤维化的重要病理反应，炎症因子释放能够激活心肌成纤维细胞，导致胶原过度代谢分解，从而导致心肌细胞坏死、变性，继发心肌纤维化[16]。抗炎治疗对于减轻心肌纤维化具有重要意义。TNF-α、IL-6、CRP是目前应用比较广泛的炎症因子，无论在炎症反应或损伤组织中，TNF-α、IL-6、CRP表达增加均能够较好地反映炎症程度[17]。本研究结果显示，瓜蒌提取物组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP均低于模型组；说明瓜蒌提取物具有一定抗炎作用。

综上所述，瓜蒌提取物能够减轻ICM大鼠心肌纤维化程度，其作用机制与抗氧化、抗炎作用有关。

参考文献:

[3]卢鹏飞,施伟丽,王志国,等.瓜蒌皮的临床应用及作用机制[J].中医杂志,2013,54(16):1428-1431.

[4]宋宇亭,杨征,李俊萍,等.瓜蒌皮提取物对急性冠脉综合征病人PCI术后血管内皮及血小板功能的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2017,15(18):2237-2238.

[5]楚冬海,张振秋.瓜蒌皮提取物对缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞的保护作用及其机制研究[J].中国药房,2019,30(8):1072-1078.

[6]李少情,张青山,赵婷,等.黄芪注射液对缺血性心肌病大鼠心肌的保护作用[J].中国应用生理学杂志,2022,38(1):75-78.

[7]张恒勋,李海龙,刘小锋.瓜蒌薤白桂枝汤对老年冠心病患者的临床观察[J].世界中医药,2020,15(8):1157-1161.

[8]李琳,雷军宁,张佳,等.瓜蒌黄芪桂枝汤治疗病毒性心肌炎(气阴两虚证)临床疗效及对中医症状积分及心功能影响研究[J].四川中医,2021,39(8):63-66.

[9]张晶晶,揭琼,朱余兵.一测多评法同时测定瓜蒌皮注射液中6种有效成分含量[J].中国药师,2018,21(10):1779-1782.

[10]李鑫飞,伏瑶,周继栋,等.瓜蒌皮对急性心肌缺血大鼠内皮祖细胞的动员作用及机制研究[J].中华中医药杂志,2019,34(3):1210-1214.

[11]单红燕,高兆慧,伏瑶,等.瓜蒌皮不同提取物干预急性心肌缺血的药效学研究[J].山东中医杂志,2017,36(5):414-418.

[13]胡超群,薛慧文,郑书臣,等.瓜蒌皮提取物对缺血缺氧心肌细胞保护效果及抗氧化能力研究[J].辽宁中医药大学学报,2020,22(3):15-18.