腰痛是造成巨大社会负担，严重影响人类生存质量的重大问题[1]。腰椎间盘退变（intervertebral disk degeneration,IDD）是临床上腰痛疾病发生与发展的重要原因[2]。IDD引起的腰痛属中医学“腰痛”范畴，多因机体肝肾亏虚，风寒湿邪杂至，致使人体气血不通、骨节错乱，是本虚标实、虚实夹杂之证。独活寄生汤出自《备急千金要方·卷八治诸风方》，长于祛风湿、止痹痛、补肝肾、益气血，其在腰痛的治疗上运用较为普遍。本实验通过“腰椎后柱结构部分切除术+寒湿环境饲养”构建SD大鼠寒湿阻滞型腰痛动物模型，并用独活寄生汤对其进行干预，以期为评估独活寄生汤治疗寒湿阻滞型腰痛疗效提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级6周龄雄性SD大鼠24只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体质量（160±20) g，动物许可证号：SCXK（湘）2020-0010，在湖南中医药大学第一附属医院实验中心适应性饲养7 d，每笼4只，标准颗粒饲料及饮用水饲养，室温环境21～23℃，空气相对湿度30%～40%，维持12 h昼/夜光线。连续观察7 d，所有SD大鼠无疾病及异常后开始实验。所有操作符合实验动物伦理学要求，已通过湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审查，伦理审查编号：ZYFY20220221-09。

1.2实验中药

独活寄生汤组成：独活9 g，桑寄生6 g，秦艽6 g，防风6 g，细辛6 g，川芎6 g，当归6 g，熟地黄6 g，白芍6 g，肉桂6 g，茯苓6 g，杜仲6 g，牛膝6 g，党参6 g，甘草6 g。由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供。煎煮2次，第1次加6倍量蒸馏水，浸泡20 min，煮沸后继续煎煮30 min，过滤后取滤液，将药渣再加4倍量蒸馏水，煮沸后继续煎煮30 min，过滤后将2次药液合并减压，浓缩至2 g/m L备用。

1.3主要试剂及仪器

碘伏消毒液（山东消博士消毒科技股份有限公司，批号：Q/371402AXX022）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：1000921）；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号：020402）；青霉素（华北制药股份有限公司，批号：F3117217）；多聚甲醛（广州赛国生物科技有限公司，批号：70111800);HE染液（宁波同盛生物科技有限公司，批号：20170032）。

电子天平（日本岛津公司，型号：ATY224）；病理组织漂烘仪（常州派斯杰医疗设备有限公司，型号：PH60）；切片机（德国莱卡公司，型号：leica UC-7）；显微镜（德国Motic公司，型号：BA210T);CT机（德国西门子公司，型号：SOMATOM go.Top）。

1.4实验动物分组与造模

适应性饲养7 d后，将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组和独活寄生汤组，每组8只，每只大鼠常规称质量并记录。大鼠予碘伏消毒液与75%乙醇交替消毒腹部，无菌条件下予戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔给药麻醉。空白组不予特殊处理；模型组、独活寄生汤组大鼠麻醉后，俯卧位置于手术台上，剪去背部鼠毛，消毒，铺无菌洞巾，沿背部正中线切开皮肤，逐层分离皮下组织、肌肉，暴露腰椎2～4节段，切除破坏腰椎2～4棘上韧带、棘间韧带及两侧上下关节突关节，压迫止血后逐层缝合切口（见图1）。术后3 d依据体质量结果，按20 000 U/100 g剂量，臀部肌内注射青霉素预防感染。空白组大鼠继续饲养于标准环境饲养笼，模型组、独活寄生汤组大鼠饲养于模拟寒湿环境饲养箱中，每天6 h，温度4～6℃，空气相对湿度60%～75%，连续饲养6周。结合相关参考文献及课题组经验，设定造模成功的标准：造模后大鼠宏观表现为畏寒喜暖、形体少动、肢体倦怠、大便稀溏等寒湿证临床特点[3]；微观表现为CT三维成像出现腰椎曲度异常、椎体序列紊乱、椎间高度降低等脊柱病变；且椎间盘髓核组织HE染色出现髓核组织破坏、结构紊乱、空泡样改变、炎性细胞浸润等椎间盘退变表现。

图1 SD大鼠腰椎后柱结构部分切除术

1.5实验动物给药

造模2周后，空白组、模型组大鼠予等体积蒸馏水灌胃处理；独活寄生汤组大鼠按人-鼠等效剂量换算服药量[4]，[大鼠剂量（mg/kg)=W×人剂量（mg/kg）]，按每只大鼠体质量予以独活寄生汤18.6 g/（kg·d）灌胃给药，每天2次。连续给药4周。

1.6观察指标与方法

1.6.1一般情况

造模过程中，观察各组大鼠的活动状态、皮毛光泽度、精神状态、反应灵敏度、大便性状、体质量等。

1.6.2自发性疼痛行为学评分

采用双人独立、双盲观察记录。使大鼠适应环境30 min后开始记录，取平均值为得分。各组大鼠在造模前，造模后1、2周，给药后1、2、3周进行自发性疼痛行为学评分。动物自发性疼痛行为学评分标准：0分为运动行为正常，后爪无畸形；1分为运动行为基本正常，后爪明显畸形，肢体舔咬≤2次；2分为运动行为轻度异常，有跛行、垂足现象，肢体舔咬>2次但≤4次；3分为运动行为严重异常，后爪萎缩，有舔噬现象，舔咬肢体≥5次[5,6]。

1.6.3动物神经功能评分

采用双人独立、双盲观察记录。使大鼠适应环境30 min后开始记录，取平均值为得分。各组大鼠在造模前，造模后1、2周，给药后1、2、3周进行神经功能评分。动物神经功能评分法判断标准：0级为行为正常，计2分；1级为甩尾无力，计4分；2级为后肢无力，行走时轻度失稳，计6分；3级为后肢无力，行走时明显不稳定，计8分；4级为站立不稳，但后肢能够移动，计10分；5级为瘫痪，后肢无自主移动，计12分[7,8,9]。

1.6.4 CT三维成像检测

灌胃4周结束后，在各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉条件下行CT检测，获取活体脊柱三维重建图，评估各组大鼠脊柱生理曲度形态改变情况。

1.6.5组织病理学染色

灌胃4周结束后，常规处死各组大鼠，解剖获取腰椎2～4节段，用10%甲醛固定。经过脱钙、脱水后，嵌入石蜡中，然后切取腰椎2～4节段纤维环髓核组织蜡片，并用苏木精和伊红染色，再放入95%乙醇中脱水。置于显微镜下进行观察和拍照，比较各组大鼠髓核病变程度。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件处理分析，实验数据用表示，组间差异采用两样本均数比较的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1一般情况比较

造模前，各组大鼠一般情况正常，且基本一致，体质量差异无统计学意义（P>0.05）。造模后1周，与空白组比较，模型组、独活寄生汤组大鼠见明显少动、皮毛无光泽、嗜睡蜷缩、反应迟钝、大便稀溏表现，体质量减轻（P<0.05）。详见表1。

2.2自发性疼痛行为学评分比较

造模前，各组大鼠自发性疼痛行为学评分差异无统计学意义（P>0.05）。造模后1、2周及给药后1、2、3周，与空白组比较，模型组和独活寄生汤组自发性疼痛行为学评分升高（P<0.05）。给药后3周，与模型组比较，独活寄生汤组自发疼痛行为学评分降低（P<0.05）。与造模后1、2周及给药后1、2周比较，给药后3周独活寄生汤组自发疼痛行为学评分降低（P<0.05）。详见表2。

表1 各组大鼠体质量比较

2.3神经功能评分比较

造模前，各组大鼠神经功能评分正常，组间差异无统计学意义（P>0.05）。造模后1、2周及给药后1、2、3周，与空白组比较，模型组和独活寄生汤组神经功能评分升高（P<0.05）。给药后3周，与模型组比较，独活寄生汤组神经功能评分降低（P<0.05）。与造模后1、2周及给药后1、2周比较，给药后3周独活寄生汤组神经功能评分降低（P<0.05）。详见表3。

2.4 CT三维成像检测比较

给药后4周，空白组大鼠腰椎曲度尚可，椎体序列基本正常，未见明显钙化，椎间高度正常。模型组、独活寄生汤组大鼠均出现不同程度的腰椎曲度异常，可见增生骨赘，形态欠完整，椎体序列紊乱，有钙化倾向，椎间高度降低。但与模型组比较，独活寄生汤组影像学退变程度较轻。详见图2。

图2 各组大鼠脊柱CT三维重建图

2.5组织病理学染色比较

空白组大鼠椎间盘髓核组织结构形态基本正常，炎性细胞浸润不明显。模型组大鼠椎间盘髓核组织被破坏，结构紊乱，空泡样改变明显，伴明显炎性细胞浸润。独活寄生汤组大鼠椎间盘髓核组织见结构部分修复，结构稍紊乱，空泡样改变不明显，少许炎症细胞浸润。详见图3。

图3 各组大鼠椎间盘髓核组织HE染色（×200)  

表2 各组自发性疼痛行为评分比较  

表3 各组神经功能评分比较 

3、讨论

腰背部疼痛是腰痛的主要临床特征，腰椎是腰背部重要的支撑结构，其稳定性主要依靠主动收缩系统、被动支持系统和神经系统间的协调平衡[10]。腰背部肌肉力量下降、腰椎小关节病变、IDD、腰背部神经根及背根神经节病变等均是腰痛发病的重要因素[11,12,13,14]。发病过程的追溯、疼痛学评定、躯体功能的测定、影像学检查等是目前评价腰痛疾病的主要手段[15,16,17]。中医学认为，外感风寒湿邪、跌仆闪挫，以及肝肾亏虚、气血不荣均可诱发腰痛，而寒湿侵袭，经络痹阻不通，经脉失于濡养，是腰痛的主要病因，故寒湿型腰痛是临床腰痛的常见证型[18]。前期已有实验研究运用动物行为学观察、神经功能评分、影像学检测及组织病理学染色等方法评价脊柱疾病动物模型[6,9,19,20]。基于以上背景，本研究尝试通过SD大鼠“腰椎后柱结构部分切除术+寒湿环境饲养”实验方法，达到破坏脊柱力学稳定、降低大鼠腰背肌力量及寒湿病因施加的目的，从而构建稳定、可靠的寒湿阻滞型腰痛大鼠动物模型，并尝试通过大鼠一般情况观察、疼痛行为学评分、动物神经功能评分、CT三维成像检测及组织病理学染色评价该腰痛疾病动物模型，以期为深入研究寒湿阻滞型腰痛提供基础。实验结果证实，“腰椎后柱结构部分切除术+寒湿环境饲养”方法，能为研究腰痛发病机制及干预方法提供良好的动物模型。但由于实验动物和实验手段的局限性，暂未能实现对活体动物模型椎间盘结构病变直接、动态的观察，仍需今后深入探索与研究。

独活寄生汤出自《备急千金要方·卷八治诸风方》，方中独活、桑寄生、秦艽、防风、肉桂、细辛为辛温之品，可解风寒湿邪、止腰膝背痛；熟地黄、当归、川芎、白芍、杜仲、牛膝为滋阴养血之品，可滋补肝肾之阴；茯苓、党参、甘草为益气之品，以养诸脏之阳[21]。有研究证实，独活寄生汤能发挥良好的镇痛消炎作用，能减缓神经根局部充血水肿，改善局部循环，促进炎症物质的吸收，从而治疗IDD[22]。前期有研究也证实，中、高剂量的独活寄生汤可调控SD大鼠骨代谢水平，改善大鼠的骨关节退变[23,24]。本研究发现，独活寄生汤在SD大鼠寒湿阻滞型腰痛发病早期，开始干预3周左右，可改善该动物模型疼痛行为学评分和神经功能评分；CT三维重建见独活寄生汤组大鼠腰椎曲度异常，椎体序列紊乱，椎间高度降低，较模型组更不显著；椎间盘髓核组织HE染色提示，与模型组比较，独活寄生汤组大鼠见椎间盘髓核组织部分修复，结构稍紊乱，空泡样改变不明显，少许炎症细胞浸润。说明独活寄生汤具有改善寒湿阻滞型腰痛大鼠动物模型脊柱病变的功效，其具体机制值得今后深入研究。

腰痛已成为全球致残前10位的危险因素，其危险性已高于心理疾病与糖尿病等[25]。有报道指出，50%以上的成年人都曾罹患腰痛，全球每年因腰痛而产生的误工费、治疗费及残疾费等费用已超过其他运动系统疾病，甚至有患者因腰痛导致劳动能力和经济收入下降而致贫[26]。在腰痛研究中，要获得人退变椎间盘组织相对困难，也很难获得正常人椎间盘组织作为对照，动物模型仍然是实验研究的主要方式[27]。寒湿诱发的腰痛疾病，往往表现为神疲乏力、形体疼痛、肢体倦怠、大便稀溏等[28]，建立与临床寒湿表现类似的动物模型，是深入研究寒湿诱发疾病本质的必要条件[29]。目前，对于IDD所诱发腰痛疾病的用药也相对局限，临床多以糖皮质激素、非甾体抗炎药等药物为主，其具有抗炎、镇痛、消水肿等作用，但长期运用糖皮质激素易诱发骨质疏松、向心性肥胖等不良反应，而非甾体抗炎药可诱发心血管系统、消化系统不良反应[30,31]。中医药安全、高效治疗腰痛的社会价值日益为人们所重视。本研究针对寒湿阻滞型腰痛动物模型的构建及独活寄生汤干预效果进行探索实验，将为科学构建寒湿阻滞型腰痛动物模型提供有益参考，为深入评价独活寄生汤治疗腰痛疗效及机制奠定基础。

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基金资助:湖南省自然科学基金青年基金项目(2022JJ40333); 湖南省卫生健康委员会科研计划项目(202104071103); 湖南省中医药科研计划项目(2021251); 湖南中医药大学校级科研基金项目(ZYYDX201728);

文章来源:汤小康,肖可,王攀,等.寒湿阻滞型腰痛大鼠模型构建及独活寄生汤干预效果的实验研究[J].湖南中医药大学学报,2024,44(06):976-981.