自由基是在人体生命活动中产生的高度活跃的分子或原子，自由基的产生及清除在正常情况下处于动态平衡状态，然而当体内自由基产生过多或清除过慢时，则会破坏这种动态平衡，导致自由基在体内积累，这些积累的自由基会对机体造成损伤，引起机体的氧化应激、炎症等一系列反应[1]。西洋参红景天复配方源于北京中医药大学高学敏教授的临床经验方，是在中医基础理论的指导下，结合现代营养学研究成果，选用西洋参、红景天、针叶樱桃粉、葡萄籽提取物配方而成，主要针对气阴两虚型中老年人，以期达到益气养阴的功效和抗氧化作用。西洋参、红景天、针叶樱桃粉及葡萄籽提取物常用于抗氧化功能的保健食品中，有研究表明，四者皆有较强的抗氧化活性，可有效清除自由基[2,3,4,5]。本研究参照《保健食品功能检验与评价方法》(2023年版),采用乙醇氧化损伤小鼠动物模型，研究西洋参红景天复配方(以下简称复配方)的抗氧化功能，旨在为此复配方保健食品的开发提供科学的实验依据。

1、材料与方法

1.1 材料与仪器

KM小鼠[斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010],SPF级，雄性，体质量25～30 g, 3周龄。饲养于北京中医药大学动物房，动物饲养室温度为20～24 ℃,相对湿度为40%～70%,自由饮水，自由摄食。伦理审查编号：BUCM- 4-2019110201- 4032。

丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)试剂盒，均购自南京凯基生物工程研究所(批号20210819);谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(Triglyceride, TG)试剂盒、蛋白质羰基(Protein carbonyl, PCO)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所(批号20210819);谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、8-表氢氧异前列腺素(8-Isoprostane)试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司(批号20220219);肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-a, TNF-α)试剂盒(批号E-MSEL-M0002)、白细胞介素-1β(Interleukin-1B,IL-1β)试剂盒(批号E-MSEL-M0003)、白细胞介素- 6(Blood interleukin- 6,IL- 6)试剂盒(批号E-MSEL-M0001),均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；75%乙醇(批号B70001),购自北京亿泰石油化工有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号P0012),购自上海碧云天生物技术股份有限公司；小鼠单抗β-actin(批号66009-1-Ig),购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔多抗p-p38(批号AF4001)、P-ERK试剂盒(批号AF1015)、P-JNK试剂盒(批号AF3318),均购自江苏亲科生物研究中心有限公司。

电子天平(上海浦春计量仪器有限公司，型号JY203型)、冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司，型号TGL-16A型)、水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司，型号HHS-S4A)、全自动研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司，型号KH-Ⅲ)、酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司，型号DR-200BS);电转仪、垂直电泳槽(北京六一仪器厂，型号DYCZ- 40、DYCZ-24DN)。

1.2 方法

1.2.1 受试样品

西洋参(珠海市健兴药业有限公司，批号201101)、红景天(亳州市京皖中药饮片厂，批号170401)、针叶樱桃粉(上海百萦生物科技有限公司，批号000719PAS)、葡萄籽提取物(天津尖峰天然产物研究开发有限公司，批号002-2011081-18)。西洋参和红景天均按《中国药典》用量下限设为3.0 g/d; 葡萄籽提取物中原花青素含量为60%,剂量为0.2 g/d; 针叶樱桃粉中VC含量为17%,剂量为0.8 g/d, 即西洋参、红景天、葡萄籽提取物、针叶樱桃粉质量之比为15∶15∶1∶4。

取配方量的西洋参、红景天加10倍量水煎煮3次，每次1.5 h, 过滤，备用。滤液减压浓缩[-0.06～ -0.10 MPa, ≤70 ℃]至相对密度为1.05～1.10,(60±2)℃的清膏，离心。离心液继续减压浓缩至相对密度为1.25～1.35,(60±2)℃的稠膏，将稠膏减压干燥，粉碎过80目筛，得浸膏粉，备用。按配方量称取针叶樱桃粉、异麦芽酮糖醇、微晶纤维素，与浸膏粉一起置于湿法制粒机中混合5 min, 以90%乙醇(占处方总量约12%)作为润湿剂制软材，20目制粒，(50±5)℃干燥(颗粒含水量控制在5%以下),18目整粒，得干颗粒，备用；称取配方量的葡萄籽提取物与干颗粒等量递增混合2次，再加入配方量的硬脂酸镁，混合5 min, 得混合粉。

1.2.2 给药与造模

将50只小鼠适应性喂养7 d, 按体质量随机分为五组，即空白对照组、模型组、西洋参红景天复配方低剂量组(330 mg/kg)、中剂量组(660 mg/kg)、高剂量组(990 mg/kg),每组10只。小鼠灌胃给予受试药物溶液，每日1次，给药体积为10 mL/kg, 空白对照组和模型组给予同等剂量的蒸馏水，给药量根据每周体质量增减调整，连续灌胃30 d。30 d后，除空白对照组外，其余各组禁食16 h(过夜),按12 mL/kg 一次性灌胃给予50%乙醇，制备乙醇氧化损伤小鼠模型，6 h后眼眶采血，解剖取下肝组织，称重并冻存。

1.2.3 指标测定

小鼠眼眶采血置于离心管中，室温静置1 h, 4 ℃、3 000 r/min 离心15 min, 按相应试剂盒要求检测小鼠血清中MDA、8-Isoprostane、PCO、GSH的含量与SOD、GSH-Px、AST、ALT的活力，以及TNF-α、IL-1β、IL- 6浓度；取小鼠肝组织，经研磨离心后取上清，采用相应试剂盒检测肝脏中MDA、PCO、GSH、TG的含量与SOD的活力。

1.2.4 Western Blot检测丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases, MAPK)信号通路蛋白表达

取少量剪碎的肝脏组织，加入细胞裂解液与蛋白酶抑制剂，匀浆后于冰上充分裂解，以离心半径10 cm, 4 ℃,12 000 r/min离心5 min, 取上清液，样品浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定，蛋白上清液与上样缓冲液进行沸水浴变性。将制备好的蛋白样品进行电泳，湿法转膜至活化的PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h, TBST洗膜3次，每次5 min, 随后加入一抗p38(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)、P-ERK(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000),4 ℃过夜孵育，后洗膜添加二抗(1∶10 000)孵育2 h。经显色、曝光，使用ImageJ软件分析检测结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS27.0统计学软件进行数据分析，服从正态分布的计量资料采用x¯±s

表示，采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验；不同时间点体质量比较采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 小鼠体质量变化

饲养过程中称量第1次给药前及给药后第1周、第2周、第3周、第4周小鼠体质量，小鼠体质量随饲养时间增长而增加，各组间小鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 给药前后小鼠体质量(x¯±s,g)

2.2 各组小鼠血清MDA、8-Isoprostane、PCO、GSH含量及GSH-Px、SOD活力比较

与空白对照组比较，模型组小鼠血清中8-Isoprostane、PCO含量均显著上升(P<0.05),GSH含量及GSH-Px、SOD活力均显著下降(P<0.05);与模型组比较，西洋参红景天复配方低剂量组MDA含量有所降低(P<0.05),低、中、高剂量组小鼠血清中8-Isoprostane、PCO含量均降低(P<0.05),GSH含量及GSH-Px、SOD活力均显著上升(P<0.05),见表2。

表2 西洋参红景天复配方对小鼠血清MDA、8-Isoprostane、PCO、GSH含量及GSH-Px、SOD活力的影响

2.3 各组小鼠肝脏MDA、PCO、TG、GSH含量及SOD活性比较

与空白对照组比较，模型组小鼠肝脏MDA、PCO和TG含量均显著上升(P<0.05),SOD活性和GSH含量均显著下降(P<0.05);与模型组比较，西洋参红景天复配方低、中剂量组小鼠肝脏MDA含量下降(P<0.05),各剂量组肝脏PCO、TG含量均下降(P<0.05),低、中剂量组SOD活性均上升(P<0.05),低剂量组GSH含量显著上升(P<0.05),见表3。

表3 西洋参红景天复配方对小鼠肝脏MDA、PCO、TG 、GSH含量及SOD活性的影响

2.4 各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL- 6浓度及AST、ALT活力比较

与空白对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL- 6水平均上升(P<0.05);与模型组比较，西洋参红景天复配方低、中、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL- 6水平均降低(P<0.05)。提示复配方可抑制促炎因子的表达，改善酒精性肝损伤引起的炎症反应。与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活力均升高(P<0.05);与模型组比较，各剂量组血清ALT、AST活力均下降(P<0.05),见表4。

表4 西洋参红景天复配方对小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL- 6浓度及AST、ALT活力的影响

2.5 西洋参红景天复配方对小鼠肝脏MAPK信号通路的影响

每组随机选取3个样本平行进行Western blot检测，结果表明，与空白对照组比较，模型组中p-p38、p-ERK和p-JNK的水平明显增加(P<0.05);与模型组比较，低剂量组p-p38和p-JNK的表达显著降低(P<0.05),中、高剂量组p-p38、p-ERK和p-JNK的表达显著降低(P<0.05),见表5、图1。

表5 西洋参红景天复配方对小鼠肝脏中p-p38,p-ERK和p-JNK表达的影响

图1 西洋参红景天复配方对MAPK信号通路中p-p38,p-ERK和p-JNK的影响

3、讨论

过量乙醇的摄入会引起体内自由基反应发生失衡，过氧化产物增加。脂质过氧化终末产物MDA、8-Isoprostane的含量可以反映过氧化损伤和细胞受损程度；碳水化合物和脂质的氧化可产生反应性羰基，活性氧和反应性羰基与蛋白质结合导致血浆和组织中羰基化功能障碍蛋白质形成，PCO含量升高标志着氧化应激依赖性细胞损伤[6]。氧化损伤是酒精性肝损伤的重要机制之一，乙醇经肝脏代谢时，细胞内产生ROS,消耗大量还原性物质SOD、GSH-Px、GSH,造成抗氧化能力下降，无法清除过多自由基，从而引起氧化应激，导致细胞脂质过氧化产物迅速增加，肝细胞膜受损[7,8,9]。酒精性肝损伤的发展与异常释放的炎症细胞因子及异常激活的炎症反应密切相关[10]。TNF-α主要由活化的巨噬细胞或单核细胞分泌，可导致肝细胞坏死，TNF-α还可激活NF-κB增加IL-1β和IL- 6的释放，使炎症反应程度明显加重，加速肝细胞坏死，推进酒精性肝病进展[11,12]。ALT与AST是评估肝脏功能的重要指标，当肝组织损伤时，细胞的胞浆及线粒体分别将ALT、AST释放入血中，造成ALT、AST在血清中的含量有不同程度的升高[13]。乙醇还会影响脂肪代谢，造成TG在肝细胞内沉积，TG的大量蓄积导致病变[8,14]。

p38-MAPK、JNK和ERK是组成MAPK信号通路的三条途径，在炎症因子和氧化应激的刺激下可被磷酸化激活，增加炎症因子的释放，在酒精性肝炎的炎症反应中发挥重要作用[15]。NF -κB P65作为转录因子，可被p-p38 MAPK激活，在炎症进程中起着核心作用，能调节TNF-α、IL-1β、IL- 6等炎症因子的转录与合成，在体内引发炎症反应[16]。另有研究表明，酒精性肝炎发病时，p38的活化明显增强，p38 MAPK由氧化应激或内质网应激引起肝细胞细胞外囊泡(Extracellular Visicles, Evs)的分泌，Evs的释放引起中性粒细胞的炎症及ROS的产生，导致肝脏的损伤[17]。本实验结果表明西洋参红景天复配方可以通过调节MAPK通路来增加机体抗氧化酶活性，减轻脂质和蛋白质的过氧化，同时还能抑制炎症反应，对肝损伤起到保护作用。

综上所述，西洋参红景天复配方可以通过抑制MAPK通路的活化，提高抗氧化能力、拮抗氧化损伤，抑制促炎因子的表达，起到抗衰老作用，具有进一步开发为保健食品的价值。

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基金资助:国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项(2018YFC1706803);

文章来源:冯颖童,扈觐玺,刘佳琪,等.西洋参红景天复配方对氧化损伤模型小鼠的抗氧化作用及机制[J].国际老年医学杂志,2024,45(04):397-402.