胡椒科（Piperaceae）胡椒属Piper Linn.植物主产于全球的热带地区，大约含有2 000种，我国现存约有60余种，分布于台湾经东南至西南部各省区[1]。胡椒属植物入药使用已经有上千年历史，在《证类本草》《本草纲目》等著作中，对相关植物记载道：“为藤本，苗如马鞭有节，叶如杏叶而尖，四时不凋，茎叶皆凑臭而极辣”[2]。该科属植物在民间已有20多种入药，主要用于通经络、祛风湿，现代研究表明，其植物主含木脂素、生物碱、黄酮、挥发油等成分，在抗血小板聚集、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗感染等方面具有较好的药理活性[3-4]。

海风藤为胡椒科植物风藤Piper kadsura(Choisy) Ohwi的干燥藤茎，又名爬岩香、岩胡椒，因其常攀爬于岩石和树木上、不断向外延伸的藤类形态为人所知，主要分布于广东、福建、台湾等沿海地区[5]。据《中国药典》2020年版记载该中药性味辛、苦，微温，具祛风湿、通经络、止痹痛的功效，因此民间多用于风寒湿痹、肢节疼痛等症状[6]。现代研究表明其多含有新木脂素和酰胺类生物碱等成分，对于药理活性研究则多集中于血小板活化因子拮抗作用、神经保护、抗炎镇痛等方面[7-10]，其他药理活性研究少有报道，而海风藤作为胡椒科属植物具有种类多样的化学成分以及丰富的药理活性，还需要进一步深入研究，因此为了深入挖掘海风藤化学成分和丰富海风藤的药理活性，本研究对海风藤藤茎部分的醋酸乙酯提取物进行系统的化学成分研究，并探究所得化合物在抗菌及抗冠状病毒的药理活性，共分离得到16个化合物（图1），分别鉴定为trans-2-methoxy-4.5-methyl-enedioxy-cinnamoylpiperidide(1）、cis-2-methoxy-4.5-methylenedioxycinnamoy1-piperidide (2）、3-(4,7-dimethoxy-1,3-benzodioxol-5-yl)-1-(1-piperidinyl)-2-propen-1-one(3）、4-[5-[(1E)-3-hydroxy-1-propen-1-yl]-7-methoxy-3-methyl-2-benzofuranyl]-2-methoxyphenol (4）、methyl (2E,4E)-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-pentadienoate(5）、胡椒酸（piperic acid,6）、辛夷脂素（fargesin,7）、denudatin B (8）、1-cinnamoylpyrrolidine(9）、假蒟亭碱（sarmentine,10）、胡椒碱（piperine,11）、胡椒新碱（piperanine,12）、(E,E)-N-isobutyl-2,4-octadienamide(13）、4-allylbenzene-1,2-diol(14）、rabdosia acid A(15）、白桦脂酸（betulinic acid,16），其中化合物1～6为首次分离得到的天然产物，并首次提供化合物1～5的核磁数据；化合物15和16为首次从胡椒科植物中分离得到；化合物7、9～12、14为首次从海风藤植物中分离得到。

图1 化合物1～16的化学结构

1、仪器与材料

Bruker AV-400 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；Waters 2695 LC偶联Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS液质联用仪；XHRE-2000A旋转蒸发仪（上海霄汉实业发展公司）；Agilent 1100制备型高效液相（美国安捷伦公司）；Waters Sunfire®RP C18制备型色谱柱（150 mm×30mm,5μm）；多功能酶标仪（Perkin Elmer公司）；柱色谱硅胶（200～300、300～400目，青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司）；制备型高效液相所用试剂为色谱纯级别，其他实验所用有机试剂均属分析纯级别；盐酸万古霉素（德国Biofroxx公司，批号EZ2811D345）；耐甲氧西林金黄色球菌Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA JCSC4469，中国科学院华南植物园邱声祥课题组友情赠送）、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus (B.cereus CMCC63301)、蜡样芽胞杆菌Staphylococcus aureus(S.sureus CMCC26003）菌株（广东省微生物菌种保藏中心）；新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂（上海碧云天生物科技有限公司）；恒温培养箱（日本SANYO公司）；多功能酶标仪（Perkin Elmer公司）。

海风藤药材于2023年9月采购于安徽亳州药材市场，由广州中医药大学中药学院吴杰伟副研究员鉴定为胡椒科植物风藤P.kadsura (Choisy) Ohwi的干燥藤茎。

2、提取与分离

取海风藤药材20 kg，用40 L的95%乙醇常温下浸泡提取2次（每次7 d），合并2次提取液，减压浓缩，得到总浸膏，再将总浸膏混悬于水中，用醋酸乙酯萃取3次后回收溶剂得到醋酸乙酯部分482.24 g，将该部分采用MCI柱色谱，用乙醇-水（0∶50、80∶20、100∶0）梯度洗脱，收集各流分后减压浓缩，得50%乙醇浸膏136.57 g、80%乙醇浸膏109.86 g、100%乙醇浸膏101.76 g。

将80%乙醇部分浸膏109.86 g经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）梯度洗脱，得到15个组分（Fr.A～O），组分Fr.C(26.99 g）经凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，得到6个子组分（Fr.C1～C6），其中Fr.C3有晶体析出，得到化合物16(11 mg），子组分Fr.D(3.78 g）经凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，得到3个组分（Fr.D1～D3),Fr.D1、Fr.D2分别经半制备高效液相纯化，用乙腈-水（40∶60→80∶20）梯度洗脱，体积流量20 m L/min,Fr.D1经纯化得化合物15(12.8 mg,tR=63 min),Fr.D2经纯化得化合物5(7.0 mg,tR=20 min）、13(11.8mg,tR=31 min）、8(46.1 mg,tR=41 min),Fr.D3经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）梯度洗脱，得3个组分（Fr.D3A～D3C），其中Fr.D3B有晶体析出，得到化合物7(19.7 mg），将Fr.D3C经半制备型液相纯化（乙腈-水40∶60→80∶20），得到化合物14(12.3 mg,tR=12 min），组分Fr.E(24.88 g）经凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，得到5个子组分（Fr.E1～E5），其中Fr.E2有晶体析出，得到化合物11(1.18 g),Fr.E5有固体析出，得到化合物3(0.35 g），组分Fr.F(3.31 g）经凝胶柱色谱分离，得到5个子组分（Fr.F1～F5），将Fr.F3经半制备型液相纯化，得到化合物1(8.2 mg,tR=18 min）、2(26.7 mg,tR=23 min），将Fr.F1经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（500∶1→200∶1）梯度洗脱，得到3个组分（Fr.F1A～F1C），将Fr.F1A经半制备型液相纯化，得到化合物12(9.9mg,tR=29 min）、10(21.0 mg,tR=39 min），组分Fr.G(2.85 g）经凝胶柱分离，得到4个子组分（Fr.G1～G4)，将Fr.G2经硅胶柱分离，以石油醚-醋酸乙酯（20∶1→0∶1）梯度洗脱，得到5个组分（Fr.G2A～G2E),Fr.G2E有固体析出，得到化合物6(13.6 mg），组分Fr.H(1.63 g）经凝胶柱色谱分离，得到5个子组分Fr.H1～H5，将Fr.H4经半制备型液相色谱纯化，得到化合物4(16.5 mg,tR=17 min），流份Fr.I(1.29 g）经凝胶柱色谱分离，得到3个子组分（Fr.I1～I3)，将Fr.I1经硅胶柱分离，以二氯甲烷-甲醇（500∶1→100∶1）梯度洗脱，得到4个组分（Fr.I1A～I1D），将Fr.I1B经半制备型液相色谱纯化，得到化合物9(3 mg,tR=13 min）。

3、结构鉴定

化合物1：淡黄色晶体（甲醇），HR-ESI-MS m/z:290.136 9[M+H]+(Calcd.290.136 0,C16H20NO4)结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C16H19NO4。该化合物为首次分离得到的天然产物，在1H-NMR中可看到反式双键的信号δH7.87 (1H,d,J=15.5Hz),6.75 (1H,d,J=15.5 Hz)，以及在13C-NMR中显示苯环信号δC154.5、149.7、141.6、117.2、106.6、94.9和酰羰基信号δC166.2，这些信号提示化合物1结构中含有肉桂酰结构片段。在二维核磁1H-1H COSY中可观察H-1′′(δH3.57,m)与H-2′′(δH1.58,m)相关，H-2′′与H-3′′(δH1.65,m)相关，H-3′′与H-4′′(δH1.58,m)相关，H-4′′与H-5′′(δH3.57,m)相关，提示化合物1结构中含有六氢吡啶结构片段，且在HMBC中可见酰羰基δC166.2与H-1′′、H-5′′相关，则该六氢吡啶结构片段与肉桂酰结构片段形成酰胺结构。此外1H-NMR中还显示2个苯环单峰质子信号δH6.96 (1H,s),6.50 (1H,s)，提示苯环为1,3,4,6-四取代，最终化合物1确定为trans-2-methoxy-4.5-methylenedioxy-cinnamoy1-piperidide，结构如图1所示。由于文献报道[11]中缺乏其有关核磁数据，因此补充并归属其核磁数据如下：1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.87 (1H,d,J=15.5 Hz,H-3),6.96 (1H,s,H-5′),6.75 (1H,d,J=15.5 Hz,H-2),6.50(1H,s,H-2′),5.92 (2H,s,OCH2O),3.79 (3H,s,OCH3),3.57 (4H,m,H-1′′,5′′),1.65 (2H,m,H-3′′),1.58 (4H,m,H-2′′,4′′)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:166.2(C-1),154.5 (C-1′),149.7 (C-3′),141.6 (C-4′),137.2(C-3),117.2 (C-6′),115.8 (C-2),106.6 (C-5′),101.6(OCH2O),94.9 (C-2′),56.6 (OCH3),47.1 (C-1′′),43.4(C-5′′),26.8 (C-2′′),25.7 (C-4′′),24.8 (C-3′′)。

化合物2：淡黄色晶体（甲醇），HR-ESI-MS m/z:290.138 0[M+H]+(Calcd.290.138 7,C16H20NO4）结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C16H19NO4。化合物2的NMR数据与化合物1极为相似，最大的不同为化合物2的双键处于顺式结构δH6.83 (1H,d,J=12.5 Hz,H-3),5.90 (1H,d,J=12.5 Hz,H-2)，最终化合物2确定为cis-2-methoxy-4.5-methylenedioxy-cinnamoy1-piperidide，结构如图1所示。同样，化合物2为首次分离得到的天然产物，文献中缺乏报道其有关核磁数据[11]，补充并归属其核磁数据如下：1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ:6.93 (1H,s,H-3′),6.83 (1H,d,J=12.5 Hz,H-3),6.49 (1H,s,H-6′),5.90 (1H,d,J=12.6 Hz,H-2),5.90 (2H,s,OCH2O),3.77 (3H,s,-OCH3),3.58 (2H,m,H-1′′),3.31(2H,m,H-5′′),1.53 (4H,m,H-2′′,3′′),1.24 (2H,m,H-4′′)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:167.8 (C-1),153.1(C-1′),148.7 (C-5′),141.4 (C-4′),128.2 (C-3),121.4(C-2),117.3 (C-2′),108.5 (C-3′),101.4 (-OCH2O-),94.6(C-6′),56.7 (-OCH3),47.5 (C-5′′),42.2 (C-1′′),26.2 (C-4′′),25.4 (C-2′′),24.6 (C-3′′)。

化合物3：无色晶体（甲醇），HR-ESI-MS m/z:320.1481[M+H]+(Calcd.320.149 3,C17H22NO5)结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C17H21NO5。同样地，化合物3的NMR数据与化合物1相似，最大的不同点为化合物3的1H-NMR中只显示1个苯环质子信号δH7.10 (1H,s,H-6′)，同时可观察到2个甲氧基信号：δH3.85 (6H,s,-2OCH3)，最终化合物3确定为3-(4,7-dimethoxy-1,3-benzodioxol-5-yl)-1-(1-piperidinyl)-2-propen-1-one，结构如图1所示。同样，该化合物为首次分离得到的天然产物，且缺乏文献报道其有关核磁数据，因此补充并归属其核磁数据如下：1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:7.64(1H,d,J=15.5 Hz,H-3),7.12 (1H,d,J=15.5 Hz,H-2),7.10 (1H,s,H-6′),6.06 (2H,s,-OCH2O-),3.85 (6H,s,2×-OCH3),3.73 (2H,m,H-1′′),3.52 (2H,s,H-5′′),1.60 (2H,m,H-3′′),1.49 (4H,m,H-2′′,4′′)；13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6) δ:164.6 (C-1),139.4 (C-5′),138.7 (C-4′),138.0 (C-3′),136.9 (C-2′),135.3 (C-3),121.2 (C-1′),117.2 (C-2),106.2 (C-6′),102.1 (-OCH2O-),60.3 (5′-OCH3),56.8 (2′-OCH3),46.0 (C-1′′),42.6 (C-5′′),26.6 (C-2′′),25.5 (C-3′′),24.2 (C-4′′)。

化合物4：无色固体，HR-ESI-MS m/z:341.137 2[M+H]+(Calcd.341.138 35,C20H21O5)结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C20H20O5。化合物4的NMR数据与已知化合物eupomatenoid-7[12]非常相似，与eupomatenoid-7的NMR数据相对比，化合物4的NMR图谱中没有显示烯烃键上的甲基信号，取而代之的是1个羟甲基信号δH4.14 (m,2H,H-9′)，因此化合物4确定为4-[5-[(1E)-3-hydroxy-1-propen-1-yl]-7-methoxy-3-methyl-2-benzofuranyl]-2-methoxyphenol，结构如图1所示。同样化合物4为首次分离得到的天然产物，文献报道[13]中缺乏其有关核磁数据，因此补充并归属其核磁数据如下：1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:7.25 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.21 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6′),7.20 (1H,dd,J=8.0,1.8 Hz,H-6),7.01 (1H,d,J=1.4 Hz,H-2′),6.93(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.63 (1H,d,J=15.9,H-7′),6.41 (1H,dt,J=15.9,5.2 Hz,H-8′),4.14 (2H,m,H-9′),3.97 (3H,s,3′-OCH3),3.86 (3H,s,3-OCH3),2.39(3H,s,H-9);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:151.1(C-7),147.8 (C-3),147.1 (C-4),144.6 (C-3′),141.4 (C-4′),132.9 (C-1′),132.6 (C-5′),129.6 (C-8′),129.2 (C-7′),121.9 (C-1),119.8 (C-6),115.9 (C-5),110.3 (C-2),109.6 (C-6′),109.6 (C-8),104.8 (C-2′),61.7 (C-9′),55.8 (3′-OCH3),55.7 (3-OCH3),9.3 (C-9)。

化合物5：黄色油状物，HR-ESI-MS m/z:233.082 7[M-H]-(Calcd.233.080 8,C13H13O4)结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C13H14O4。化合物5的NMR数据与已知化合物methyl transferulate[14]极为相似，最大不同点为化合物5中显示2个反式双键信号δH6.83 (1H,d,J=15.5 Hz,H-1),6.72 (1H,dd,J=15.5,10.7 Hz,H-2),7.43 (1H,dd,J=15.2,10.7 Hz,H-3)、5.95 (1H,d,J=15.2 Hz,H-4)，且在1H-1H COSY中可观察到H-2与H-3相关，提示该2个反式双键相连，最终化合物5确定methyl (2E,4E)-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-pentadienoate，结构如图1所示。该化合物为首次分离得到的天然产物，由于文献报道[15]缺乏其有关核磁数据，因此补充并归属其核磁数据如下：1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.43 (1H,dd,J=15.2,10.7 Hz,H-3),6.99 (1H,dd,J=8.1,2.0 Hz,H-5′),6.97 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.89 (1H,dd,J=8.1,1.7 Hz,H-6′),6.83 (1H,d,J=15.5 Hz,H-1),6.72 (1H,dd,J=15.5,10.7 Hz,H-2),5.95 (1H,d,J=15.2 Hz,H-4),3.93 (3H,s,3′-OCH3),3.76 (3H,s,-COOCH3);13C-NMR (100MHz,CDCl3) δ:167.9 (C-5),147.1 (C-4′),146.9 (C-3′),145.4 (C-3),140.9 1H (C-1),128.8 (C-1′),124.1(C-2),121.9 (C-5′),119.6 (C-4),114.9 (C-6′),108.8 (C-2′),56.1 (3′-OCH3),51.7 (5-OCH3)。

化合物6：黄色固体，HR-ESI-MS m/z:219.064 7[M+H]+(Calcd.219.0652,C12H11O4)结合1H-NMR、13C-NMR确定分子式为C12H10O4。该化合物在文献中报道为合成化合物，因此化合物6为首次分离得到的天然产物，其相对分子质量、波谱数据与文献对比一致[16]。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:7.29(1H,m,H-6′),7.23 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),6.94 (4H,m,H-2～5),6.05 (2H,s,-OCH2O-),5.92 (1H,d,J=15.2 Hz,H-5′)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:167.7 (1-COOH),148.1 (C-3′),148.0 (C-4′),144.5 (C-3),139.7 (C-5),130.6 (C-1′),124.9 (C-4),123.1 (C-2),121.4 (C-6′),108.5 (C-5′),105.7 (C-2′),101.4 (-OCH2O-)。

化合物7：白色固体，HR-ESI-MS m/z:369.206 5[M-H]-，分子式为C21H22O6。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ:6.93 (1H,s,H-2),6.87 (1H,s,H-2′),6.85(2H,s,H-5,6),6.81 (1H,d,J=1.7 Hz,H-6′),6.77 (1H,d,J=7.9 Hz,H-5′),5.94 (2H,s,-OCH2O-),4.86 (1H,d,J=5.3 Hz,H-7),4.42 (1H,d,J=7.0 Hz,H-7′),4.12(1H,d,J=8.7 Hz,H-9′α),3.90 (3H,s,3-OCH3),3.88(3H,s,4-OCH3),3.84 (1H,m,H-9α,9′β),3.31 (2H,m,H-9β,8),2.87 (1H,dd,J=15.3,5.7 Hz,H-8′)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:148.9 (C-3),148.1 (C-4),148.1 (C-3′),147.3 (C-4′),135.3 (C-1′),131.0 (C-1),119.7 (C-6′),117.8 (C-6),111.1 (C-5),109.1 (C-2),108.3 (C-5′),106.6 (C-2′),101.2 (-OCH2O-),87.8 (C-7′),82.1 (C-7),71.1 (C-9′),69.9 (C-9),56.0 (3-OCH3),56.0 (4-OCH3),54.7 (C-8′),50.3 (C-8)。以上谱学数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物7为辛夷脂素。

化合物8：黄色油状物，HR-ESI-MS m/z:357.168 2[M+H]+，分子式为C21H24O5。1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:6.99 (1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.85 (2H,m,H-2,5),6.19 (1H,s,H-2′),5.86 (1H,s,H-5′),5.83 (1H,m,H-8′),5.21 (1H,s,H-7),5.11 (1H,d,J=4.9 Hz,H-9′b),5.07 (1H,s,H-9′a),3.88 (3H,s,3-OCH3),3.87 (3H,s,4-OCH3),3.12 (2H,d,J=5.1 Hz,H-7′),3.02 (3H,s,3′-OCH3),2.67 (1H,q,J=7.6 Hz,H-8),1.11 (3H,d,J=7.5 Hz,H-9);13C-NMR (100MHz,CDCl3) δ:187.4 (C-6′),173.3 (C-4′),148.9 (C-4),148.7 (C-3),142.8 (C-1′),135.2 (C-8′),132.8 (C-2′),132.1 (C-1),118.3 (C-9′),117.3 (C-6),110.8 (C-5),109.1 (C-2),104.8 (C-5′),94.8 (C-7),81.2 (C-3′),56.0(3-OCH3),55.9 (4-OCH3),50.5 (3′-OCH3),46.9 (C-8),33.4 (C-7′),16.3 (C-9)。以上谱学数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物8为denudatin B。

化合物9：白色固体，HR-ESI-MS m/z:202.121 6[M+H]+，分子式为C13H15NO。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ:7.62 (2H,dd,J=7.7,1.8 Hz,H-2′,6′),7.58(1H,s,H-3),7.40 (3H,m,H-3′～5′),6.95 (1H,d,J=15.6 Hz,H-2),3.72 (2H,t,J=6.8 Hz,H-2′′),3.55 (2H,t,J=6.9 Hz,H-5′′),2.04 (2H,t,J=6.5 Hz,H-4′′),1.94(2H,t,J=6.8 Hz,H-3′′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ:167.0 (C-1),143.3 (C-3),136.4 (C-1′),131.0 (C-4′),130.0 (C-2′,6′),129.1 (C-3′,5′),119.7 (C-2),48.0 (C-2′′),47.3 (C-5′′),27.0 (C-4′′),25.3 (C-3′′)。以上谱学数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物9为1-cinnamoylpyrrolidine。

化合物10：黄色油状物，HR-ESI-MS m/z:222.184 3[M+H]+，分子式为C14H23NO。1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.25 (1H,dd,J=14.8,10.6 Hz,H-3),6.16 (1H,dd,J=15.3,10.6 Hz,H-4),6.09 (1H,d,J=6.7 Hz,H-2),6.05 (1H,m,H-5),3.52 (2H,m,H-4′),3.49 (2H,m,H-1′),2.12 (2H,q,J=7.1 Hz,H-6),1.93 (2H,q,J=6.8,6.1 Hz,H-2′),1.83 (2H,q,J=6.8,6.4 Hz,H-3′),1.41 (2H,q,J=7.2 Hz,H-7),1.27 (4H,m,H-8,9),0.86 (3H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C-NMR(100 MHz,CDCl3) δ:165.3 (C-1),143.2 (C-5),142.3(C-3),128.8 (C-4),119.9 (C-2),46.5 (C-1′),45.9 (C-4′),33.0 (C-6),31.5 (C-2′),28.6 (C-3′),26.2 (C-7),24.5(C-8),22.6 (C-9),14.1 (C-10)。以上谱学数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物10为假蒟亭碱。

化合物11：淡黄色晶体（甲醇），HR-ESI-MS m/z:286.142 5[M+H]+，分子式为C17H19NO3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ:7.39 (1H,m,H-3),6.97(1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.88 (1H,dd,J=8.0,1.7 Hz,H-6′),6.77 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.73 (2H,m,H-4,5),6.43 (1H,d,J=14.6 Hz,H-2),5.96 (2H,s,OCH2O),3.54 (4H,m,H-1′′,5′′),1.66 (2H,m,H-3′′),1.58 (4H,m,H-2′′,4′′)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:165.6(C-1),148.3 (C-4′),148.2 (C-3′),142.6 (C-3),138.3 (C-5),131.1 (C-1′),125.5(C-4),122.6 (C-6′),120.2 (C-2),108.6 (C-5′),105.8 (C-2′),101.4 (OCH2O),47.0 (C-5′′),43.4 (C-1′′),26.8 (C-4′′),25.7 (C-2′′),24.8 (C-3′′)。以上谱学数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物11为胡椒碱。

化合物12：浅黄色粉末，HR-ESI-MS m/z:288.158 7[M+H]+，分子式为C17H21NO3。1H-NMR(400 MHz,CD3OD) δ:6.69 (1H,m,H-3),6.68 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),6.66 (1H,d,J=6.5 Hz,H-5′),6.62(1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,H-6′),6.30 (1H,d,J=15.2 Hz,H-2),5.85 (2H,s,OCH2O),3.52 (2H,s,H-1′′),3.44 (s,2H,H-5′′),2.67 (2H,t,J=7.4 Hz,H-5),2.47 (2H,m,H-4),1.63 (2H,m,H-3′′),1.50 (4H,m,H-2′′,4′′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD) δ:167.7 (C-1),149.1 (C-4′),147.2(C-3′),146.2 (C-3),136.3 (C-1′),122.5 (C-6′),122.4 (C-2),109.9 (C-5′),109.0 (C-2′),102.1 (OCH2O),48.1 (C-5′),44.3 (C-1′′),35.5 (C-5),35.4 (C-4),27.8 (C-4′′),26.8(C-2′),25.5 (C-3′′)。以上谱学数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物12为胡椒新碱。

化合物13：无色晶体（甲醇），HR-ESI-MS m/z:196.169 0[M+H]+，分子式为C12H21NO。1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:6.12 (1H,dd,J=15.3,10.0 Hz,H-4),6.05 (1H,dt,J=15.2,6.3 Hz,H-5),5.75 (1H,d,J=15.0 Hz,H-2),3.15 (2H,t,J=6.5 Hz,H-1′),2.12(2H,q,J=7.3 Hz,H-6),1.82 (1H,m,H-2′),1.44 (2H,q,J=7.3 Hz,H-7),0.91 (6H,d,J=6.6 Hz,H-3′,4′),0.89 (3H,t,J=7.4 Hz,H-8);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:166.6 (C-1),143.2 (C-5),141.5 (C-3),128.5(C-4),121.8 (C-2),47.1 (C-1′),35.1 (C-6),28.7 (C-2′),22.1 (C-7),20.2 (C-3′,4′),13.8 (C-8)。以上谱学数据与文献报道基本一致[22]，故鉴定化合物13为(E,E)-N-isobutyl-2,4-octadienamide。

化合物14：黄色油状物，HR-ESI-MS m/z:149.061 5[M+H]+，分子式为C9H10O2。1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:6.79 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),6.71 (1H,s,H-3),6.62 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),5.92(1H,ddt,J=16.8,10.0,6.7 Hz,H-2′),5.38 (2H,s,1,2-OH),5.05 (2H,m,H-3′),3.27 (2H,d,J=6.7 Hz,H-1′)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:143.6 (C-2),141.8(C-1),137.8 (C-2′),133.4 (C-4),121.1 (C-5),115.9 (C-6),115.7 (C-3),115.5 (C-3′),39.6 (C-1′)。以上谱学数据与文献报道基本一致[23]，故鉴定化合物14为4-allylbenzene-1,2-diol。

化合物15：无色油状物，HR-ESI-MS m/z:317.207 2[M+Na]+，分子式为C18H30O3。1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.13 ((1H,dd,J=15.6,9.9 Hz,H-10),6.18 (1H,m,H-8),6.17 (1H,m,H-9),6.07 (1H,d,J=15.5 Hz,H-11),2.53 (2H,t,J=7.5 Hz,H-13),2.33 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),2.17 (2H,m,H-7),1.61(4H,m,H-3,14),1.43 (2H,m,H-15),1.31 (10H,m,H-4～6,16,17),0.89 (3H,t,J=6.8 Hz,H-18);13C-NMR(100 MHz,CDCl3) δ:201.3 (C-12),178.9 (C-1),146.0(C-8),143.2 (C-10),129.0 (C-9),128.0 (C-11),40.6 (C-13),34.0 (C-2),33.2 (C-7),31.5 (C-16),29.2 (C-5),29.2 (C-6),29.0 (C-4),28.5 (C-15),24.8 (C-14),24.5 (C-3),22.6 (C-17),14.1 (C-18)。以上谱学数据与文献报道基本一致[24]，故鉴定化合物15为rabdosia acid A。

化合物16：白色粉末，HR-ESI-MS m/z:455.354 2[M-H]-，分子式为C30H48O3。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:4.67 (1H,s,H-29α),4.55 (1H,s,H-29β),3.29 (1H,m,H-3),2.96 (1H,m,H-19),1.63 (3H,s,H-30),0.92 (3H,s,H-27),0.85 (6H,s,H-23,26),0.75(3H,s,H-25),0.64 (3H,s,H-24);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:177.3 (C-28),150.4 (C-20),109.7 (C-29),76.9 (C-3),55.5 (C-17),54.9 (C-5),50.0 (C-9),48.6 (C-18),46.7 (C-19),42.1 (C-14),40.3 (C-8),38.6 (C-1),38.3 (C-4),37.7 (C-13),36.8 (C-22),36.4 (C-10),34.0(C-7),31.8 (C-16),30.2 (C-21),29.3 (C-15),28.1 (C-23),27.2 (C-2),25.1 (C-12),20.5 (C-11),19.0 (C-30),18.0 (C-6),16.0 (C-25),15.9 (C-24),15.8 (C-26),14.4(C-27)。以上谱学数据与文献报道基本一致[25]，故鉴定化合物16为白桦脂酸。

4、生物活性测定

4.1 体外抗菌活性评价

根据文献报道方法[26]进行改良，分别将蜡样芽胞杆菌B.cereus、金黄色葡萄球菌S.aureus以及耐甲氧西林金黄色球菌（MRSA）供测菌液配制成1.25×106CFU/m L；待测化合物和阳性药万古霉素分别用DMSO配成1 mg/m L溶液后用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，万古霉素存于避光的棕色小瓶。

取20μL药物和80μL水解酪蛋白胨（mueller hinton,MH）肉汤液体培养液加入96孔板中的第1排孔中，设有待测药物组和万古霉素阳性对照组。在96孔板所有孔中加入供测菌液和刃天青显色剂（0.1 mg/m L）的混合液100μL，均匀混合后，从第1排孔中吸取100μL溶液移到第2排并吹打均匀混合。依次对半稀释，使得待测药物和万古霉素的质量浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78μg/m L，同时设置MH培养液空白对照孔以及菌液对照孔，最后将96孔板在37℃恒温培养箱下孵育10～12 h后，观察菌液颜色变化，将使菌液维持蓝色的孔对应的最低浓度确定为待测化合物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）。

结果如表1所示，化合物1～2、4～10、12～16均具有显著的抗菌活性，其中化合物1、5、6、10、12和15对金黄色葡萄球菌的MIC值均为0.78µg/m L，而化合物1～2、8～9、12和14对MRSA的MIC值均为3.12µg/m L。

表1 化合物1～16对B.cereus、S.aureus、MRSA抑制活性

4.2 抗SARS-Co V-2活性评价

采用新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒测定化合物对Mpro/3CLpro的抑制活性。严格按照试剂盒说明书上操作（Assay Buffer:2019-n Co V Mpro/3CLpro=92∶1）配制Assay Reagent溶液，在96孔板上设置空白对照组，100%酶活性对照组，阳性抑制（Ebselen溶液）对照组以及样品组。样品孔加入用DMSO溶解的待测样品溶液，样品溶液浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56μmol/L。每组设置3个复孔，依次加入测试样品溶液（5μL）和Assay Reagent溶液（93μL），混合均匀。在37℃培养箱中培养10 min后，用排枪快速向各孔中加入2μL Substrate底物（试剂盒提供），然后在37℃培养箱中孵育5 min后，用多功能酶标记物测定每个孔的荧光值，最后采用Graph Pad Prism 10软件（Graph Pad）计算化合物的IC50值。

结果如表2所示，化合物2、3、4、8、11、12、14、16均具有较强的抗冠状病毒活性。

表2 化合物1～16对SARS-Co V-2的Mpro/3CLpro抑制活性

5、讨论

近年来，对于中药海风藤的化学成分及药理作用报道较多，但其药理作用多集中于抗炎、血小板活化因子拮抗作用等[7-10]，在抗菌及抗病毒方面的药理作用鲜少报道。由于胡椒属植物经研究报道在抗菌抗病毒特别是抗冠状病毒方面均具有一定的药理活性[27-28]，因此对海风藤所分离得到的化合物进行抗菌抗病毒活性研究，对进一步应用和开发这一味中药材具有重大的意义。

本研究综合使用多种柱色谱手段，并结合如1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、HR-MS等波谱技术对海风藤的化学成分进行分离纯化与结构鉴定，共分离得到化合物16个，包含8个酰胺类生物碱（1～3、9～13）、3个木脂素（4、7～8）、1个三萜（16）等，此外化合物1～6为首次分离得到的天然产物，化合物1～5首次补充并归属其1H、13C NMR数据；化合物15和16为首次从胡椒科植物中分离得到；化合物7、9～12、14为首次从海风藤植物中分离得到。抗菌与抗SARS-Co V-2活性评价结果表明，除去化合物3和11，其余化合物在抗菌方面都具有较强的药理活性，其中化合物1、5、6、10、12和15对金黄色葡萄球菌的MIC值均为0.78µg/m L，达到与阳性对照药万古霉素相同的抑制活性，而化合物1～2、8～9、12和14对MRSA的MIC值均为3.12µg/m L，具有较为显著的抗MRSA活性；在抗冠状病毒活性方面，化合物2～4、8、11～12、14、16均具有较强的抗冠状病毒活性。以上研究结果得出化合物2、8、12在抗菌及抗冠状病毒方面均具有良好的抑制活性，本研究初步探索了海风藤化合物在抗菌及抗冠状病毒的药理作用，为进一步开发和研究海风藤这一中药以及研发相关新药提供了一定的科学依据。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81903509); 东莞广州中医药大学研究院培育项目(2023PY0102);

文章来源:林少丹,陈丽萍,潘永晨,等.海风藤化学成分及其抗菌活性和抗冠状病毒活性研究[J].中草药,2024,55(15):5024-5032.