细辛Asari Radix et Rhizoma最早记载于《神农本草经》，具有解表散寒、祛风止痛、温肺化饮之功，主治风寒头痛、牙痛、痹痛等症，至今有近2 000年的临床应用史[1-2]。直到《本草纲目》提及“细辛不过钱，过钱命相连”，细辛的毒性便开始受到关注，历版《中国药典》将细辛用量限制在1～3 g[3]。然而，为了达到特定疗效，细辛临床常常超剂量使用，如国家中医药管理局推荐的新冠肺炎防疫通用方清肺排毒汤细辛用量6 g，前期发现细辛煎剂的中毒剂量为6～15 g[4]，有报道[5]超剂量细辛散剂可诱导肝损伤，课题组前期研究发现6、12 g/kg细辛水提物均可诱导肝损伤[6]，本研究拟进一步探讨细辛水提物致肝损伤作用机制，旨在为细辛毒性研究提供依据。

1、材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（180±20)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2020-0004。动物于室温（23±1）℃、相对湿度（45±5）%、12 h光照/12 h黑暗节律的环境下饲养，给予普通清洁剂鼠饲料与饮水。动物实验经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号2024-KY-0015）。

1.2 细胞

小鼠肝实质AML-12细胞购自中科院上海细胞库。

1.3 药材

细辛购自郑州大学第一附属医院，由郑州大学第一附属医院中医药学部王娟教授鉴定为马兜铃科植物华细辛Asarum sieboldii Miq.的根及根茎。

1.4 药品与试剂

对照品细辛脂素（质量分数为98%，批号MUST-20062003）、甲基丁香酚（质量分数为98%，批号MUST-20080701）、黄樟醚（质量分数为98%，批号wkq20090701）、马兜铃酸（质量分数为98%，批号MUST-20062605）购自成都曼思特生物科技有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自北京拜尔迪生物技术有效公司；96孔板购自Costar公司；Eppendorf管购自Axygen公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）检测试剂盒（批号C009-2-1）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）检测试剂盒（批号C010-2-1）均购自南京建成生物工程所有限公司；TRIpure（批号RP1001）、Super M-MLV反转录酶（批号PR6502）、RNase inhibitor（批号RP5602）、2×Power Taq PCR Master Mix（批号PR1702）、SYBR Green（批号SY1020）购自北京百泰克生物技术有限公司；细胞色素P450 1A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1）抗体（批号00103744）、金属硫蛋白-1(metallothionein-1,MT-1）抗体（批号00003617）、肌肉特异性烯醇化酶3(recombinant enolase 3,ENO3）抗体（批号00079114）、抗原转运蛋白1(transporter associated with antigen processing 1,TAP1）抗体（批号00083475）均购自美国Protenintech公司；兔多甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1引物设计由苏州金唯智有限公司完成；β-actin抗体（批号00062315）、鼠二抗（批号20000427）、兔二抗（批号20000768）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.5 仪器

CTK132C型离心机、H-2050R型超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；EASY-n LC 1200型质谱系统、Orbitrap Exploris 480型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；LC-20A型液相色谱仪、SPD-M20A型二极管阵列检测器（日本岛津公司）；CO2培养箱（日本Sanyo公司）；超净台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；ABI7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Chemi Doc XRS+成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2、方法

2.1 细辛水提物的制备

取细辛1 kg，加水5 L煮沸1 h，去渣取汁，将残渣加水5 L再煎煮1 h，滤过，合并2次药液，冷冻干燥，备用。

2.2 细辛水提物化学成分的含量测定

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6mm,5μm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈-甲醇（3∶1），柱温38℃，检测波长240 nm，进样体积10μL，洗脱梯度：0～10 min,35%～40%B,1.0 m L/min;10～40 min,40%～45%B,1.0～0.8 m L/min;40～45 min,45%～50%B,0.8 m L/min;45～60 min,50%～52%B,0.8 m L/min;60～70 min,52%～100%B,0.8～1.0 m L/min。方法学考察中精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收试验RSD值均不大于5%，各对照品的标准曲线线性良好（r>0.999）。

2.3 动物分组、给药及取材

大鼠适应性饲养7 d后随机分为分别为对照组和细辛高、低剂量（12、6 g/kg）组，每组10只。细辛高、低剂量组大鼠ig给予细辛水提物（15m L/kg），连续给药28 d，每天1次，对照组ig给予等体积生理盐水。分别于实验第7、14、21、28天尾静脉取血，离心，取上清液，检测血清ALT、AST活性。于实验第28天处死动物，取肝脏组织进行苏木素-伊红（HE）染色观察病理组织形态，取肝脏组织检测蛋白表达变化。

2.4 蛋白组学分析

2.4.1 蛋白提取、酶解

向样品中加入裂解液（1.5%SDS、100 mmol/L Tris-HCl），充分混合均匀，组织匀浆后，离心取上清。用丙酮沉淀法对溶液中的蛋白质进行沉淀，向得到的蛋白沉淀中加入复溶液（8 mol/L尿素、100 mmol/L Tris-HCl）复溶后，加入二硫苏糖醇37℃孵育1 h；加入碘乙酰胺，于室温避光进行烷基化反应以封闭硫基。采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白质定量后取50μg样本用于SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带。向还原、烷基化后的样品中加入100 mmol/L Tris-HCl溶液，将尿素浓度稀释至2 mol/L以下，按照酶与蛋白1∶50的比例加入胰蛋白酶，37℃振荡孵育过夜进行酶切。第2天加入三氟乙酸终止酶切，取上清进行Sep-Pak C18脱盐。抽干后-20℃冻存待用。

2.4.2 TMT/i TRAQ标记

取等量的样品进行TMT标记。标记后的样品等量混合后，使用Sep-Pak C18脱盐。真空抽干后，利用high p H反向色谱分离法对混合样品进行分级分离，最终合并为15个组分。真空抽干后，存于-80℃冰箱，准备上机检测。

2.4.3 LC-MS/MS条件

采用Orbitrap Exploris 480质谱仪串联EASY-n LC 1200液相的液质联用系统进行分析，C18色谱柱（250 mm×7.5 mm,1.9μm），流动相A为1%甲酸水溶液，B为含1%甲酸的乙腈，梯度洗脱：0～42 min,6%～25%B;42～53 min,25%～45%B;53～53.5 min,45%～80%B;53.5～60 min,80%B。柱温50℃；体积流量300 n L/min；进样量10μL。

2.4.4 数据处理与分析

质谱数据通过Max Quant(V1.6.6）软件进行检索，采用Andromeda数据库检索算法。对差异蛋白进行生物信息学分析，依次使用BLAST工具进行基因本体（gene ontology,GO）功能、分类和富集分析；通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库进行代谢通路注释和富集分析。

2.5 免疫组化法测定肝组织CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1的表达

肝组织脱水后，包埋，切片，继而脱蜡复水，PBS洗涤2次，每次5 min，之后再放入蒸馏水中冲洗1次。高温修复抗原后，冷却至室温，切片用缓冲液中洗涤3次，每次5 min，然后放入盛有3%H2O2罐子中封闭15 min。将切片取出，PBS涤洗3次，每次5 min，吸去PBS，滴加血清封闭30 min，弃封闭液。滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜，次日，抖掉一抗，使用PBS清洗3次，每次10 min。滴加HRP标记的二抗（1∶8 000),37℃孵育1 h,PBS清洗3次，每次10 min。滴加DAB显色液到各个切片上，并在室温条件下显色，显色完成后放入苏木精中复染5 min。分色，蓝化，脱水透明，封片，采集切片图像，测定所采集全部图像的吸光度（A）和面积，分析各靶蛋白的表达情况。

2.6 细胞活力测定

AML-12细胞以（4×104～5×104）个/m L接种于96孔板中，每孔100μL，在37℃、5%CO2的培养箱培养24 h。每孔分别加入10μL不同质量浓度（150、75、50、37.5、30、25、21.43、18.75、16.67mg/m L，以生药量计）的细辛水提物，孵育24 h。另设置不含药物的对照组，以及不含药物不含细胞的空白孔。每孔加入10μL CCK-8溶液，于培养箱孵育4 h。采用酶标仪测定450 nm处的A值，计算细胞活力和半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）值。

2.7 Western blotting检测CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1蛋白表达

取处于对数生长期的AML-12细胞，以1.8×105个/孔接种于6孔板中。设置对照组和细辛水提物高、低剂量（29.0、14.5 mg/m L）组，待细胞贴壁后，加入含药培养基孵育24 h。收集细胞，加入裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，加入5×Loading Buffer煮沸5 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭1 h后，分别孵育一抗和二抗，加入ECL发光液进行显影，采用Image J软件分析目的蛋白灰度值。

2.8 q RT-PCR检测CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1m RNA表达

按“2.7”项下方法分组和给药，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成c DNA，进行q RT-PCR分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.9 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料服从正态分布时以表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法（方差齐时）或Dunnett’T3检验（方差不齐时）。

3、结果

3.1 细辛水提物主要成分的含量测定

按照色谱条件测定细辛水提物中细辛脂素、黄樟醚、马兜铃酸、甲基丁香酚的含量（图1、表2），符合《中国药典》2020年版一部规定，与文献报道基本一致[6]。

图1 混合对照品溶液(A)和细辛水提物(B)的HPLC色谱图

1-甲基丁香酚；2-马兜铃酸；3-黄樟醚；4-细辛脂素。

表2 细辛水提物主要化学成分含量

3.2 细辛水提物对大鼠肝功能与肝组织病理变化的影响

如表3所示，与对照组比较，实验第14天细辛高剂量组大鼠血清中AST活性显著升高（P<0.05）；第21、28天细辛高、低剂量组大鼠血清中AST、ALT活性均显著升高（P<0.01）。

如图2所示，对照组大鼠肝组织细胞的边界清晰，形态完好、整齐，细胞核明显；细辛低剂量组肝索排列稍显紊乱，偶见炎性细胞浸润；细辛高剂量组肝细胞出现轻微水肿，胞质疏松化，炎性细胞浸润加重，出现少量嗜酸性变。

表3 细辛水提物对大鼠肝功能的影响

图2 细辛水提物对大鼠肝组织病理变化的影响(HE，×200)

3.3 细辛水提物对大鼠肝组织蛋白组学的影响

上述结果发现12 g/kg细辛水煎液对肝脏损伤更为明显，故选择对照组与细辛高剂量组进行蛋白组学分析。从肝脏组织中鉴定出5 324个蛋白，以差异倍数（fold change,FC)>1.2或FC<0.833且P<0.05为筛选条件，对照组与细辛高剂量组肝脏组织中有179个差异蛋白，其中上调蛋白有90个，下调蛋白有89个，蛋白差异火山图与热图见图3、4,FC较大的20种蛋白见表4、5。

图3 差异蛋白火山图

图4 差异蛋白热图

表4 细辛水提物上调大鼠肝脏组织中的蛋白（前10)

表5 细辛水提物下调大鼠肝脏组织中的蛋白（前10)

GO富集分析发现，在生物过程分类中，细辛诱导肝损伤的差异蛋白主要涉及细胞过程、代谢过程、应激反应、生物调节等生物过程，在细胞组分分类中，这些差异蛋白主要存在于细胞结构体、蛋白体，在分子功能分类中，这些差异蛋白与催化活性、结合、分子功能调节等功能相关，见图5。

KEGG富集分析发现，细辛诱导肝损伤所涉及的信号通路有代谢通路、次级代谢产物的生物合成途径、视黄醇代谢途径、吞噬体等，见图6和表6。

3.4 细辛水提物对大鼠肝脏CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1蛋白表达的影响

如图7所示，与对照组比较，细辛高、低剂量组大鼠肝脏组织CYP1A1、MT-1阳性细胞数显著增加（P<0.01），着色加深，细辛高、低剂量组ENO3、TAP1阳性细胞数明显减少（P<0.01），着色变浅。

图5 差异蛋白的GO富集分析

图6 差异蛋白的KEGG富集分析

表6 差异蛋白的KEGG信号通路(前10)

图7 细辛水提物对大鼠肝脏CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1蛋白表达的影响

与对照组比较：*P<0.05**P<0.01，图9、10同。

3.5 细辛水提物对AML-12细胞活力的影响

如图8所示，细辛水提物作用于AML-12细胞24 h，对细胞活力的抑制作用呈剂量相关性，IC50值为51.8 mg/m L。后续实验选择对AML-12细胞活力影响较小的质量浓度，按照IC50值的1/2和1/4取整数，即细辛水提物26、13 mg/m L。

3.6 细辛水提物对AML-12细胞CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1蛋白与m RNA表达的影响

如图9所示，与对照组比较，细辛各剂量组AML-12细胞MT-1蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；细辛高剂量组CYP1A1蛋白表达水平显著升高（P<0.05),ENO3、TAP1蛋白表达水平显著降低（P<0.05、0.01）。如图10所示，与对照组比较，细辛高剂量组AML-12细胞CYP1A1 m RNA表达水平显著升高（P<0.05）；细辛各剂量组MT-1 m RNA表达水平显著升高（P<0.01),ENO3、TAP1 m RNA表达水平显著降低（P<0.01）。

图8 细辛水提物对AML-12细胞活力的影响

图9 细辛水提物对AML-12细胞CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1蛋白表达的影响

图1 0 细辛水提物对AML-12细胞CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1 m RNA表达的影响

4、讨论

细辛为马兜铃科植物北细辛A.heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum (Maxim.) Kitag.、汉城细辛A.sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或华细辛A.sieboldii Miq.的干燥根和根茎[7]。课题组前期研究明确了细辛小鼠急性毒性的半数致死剂量（median lethal dose,LD50）为50 g/kg，探讨了细辛的“量-毒-效”关系，发现12 g/kg细辛水煎液在发挥抗炎、镇痛作用的同时存在肝毒性，本研究结果显示，大鼠ig细辛28 d后，血清AST、ALT活性升高，肝组织细胞出现轻微水肿，胞质疏松化，炎性细胞浸润加重，出现少量嗜酸性变，提示肝脏功能异常，并出现病理损伤，与鲍慧中等[8]研究结果基本一致。

本研究从大鼠肝脏中检测出蛋白共5 324个，细辛组较对照组差异蛋白共179个，其中，上调蛋白有90个，下调蛋白有89个，主要富集于次级代谢产物的生物合成途径、视黄醇代谢途径、吞噬体等，这些代谢途径与CYP1A1、TAP1等蛋白密切相关，提示细辛所致肝损伤可能与CYP1A1、TAP1等蛋白的异常表达有关。CYP1A1是重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酶类，活化CYP1A1可诱导肝损伤，因为被激活的CYP1A1能将多种环境中的有机物质如多环芳烃转化为细胞毒素或其他致癌物质，从而诱发肝损伤甚至肝癌[9-11]。MT是一类富含半胱氨酸的低相对分子质量蛋白，MT包含MT-1、MT-2、MT-3、MT-4共4种亚型，MT-1在肝脏中高表达，参与金属代谢、解毒以及清除羟基自由基等过程[12-14]。ENO在糖酵解代谢途径中发挥催化作用，ENO3是ENO 3种同工酶之一，与糖原代谢、脂质代谢密切相关，ENO3在肝癌与激活的肝星状细胞中低表达，与早期肝癌的发生发展有关[15-17]。TAP1是一种分布于内质网膜及高尔基体顺面膜、属于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）结合匣超家族的转运蛋白，TAP1的异常可能是肿瘤细胞、病毒得以免疫逃避的关键机制之一[18-21]。本研究根据蛋白组学结果，选取FC较大且与肝损伤密切相关的蛋白CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1进行免疫组化实验，发现大鼠肝脏CYP1A1、MT-1蛋白表达显著增加，ENO3、TAP1蛋白表达显著降低。

为了进一步验证细辛水提物对肝脏的影响，本研究观察了细辛水提物对AML-12细胞的影响，发现细辛高剂量组细胞CYP1A1、MT-1 m RNA与蛋白表达显著增加，ENO3、TAP1 m RNA与蛋白表达水平显著降低，提示细辛水提物可能通过调节CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1的转录，进而影响它们的表达来诱导肝损伤；细辛低剂量组MT-1 m RNA与蛋白表达显著增加，其余蛋白表达未见变化，表明细辛诱导肝损伤与剂量关系较大。

综上，本研究利用蛋白组学发现12 g/kg细辛水提物可诱发肝脏功能异常，组织发生炎性损伤，蛋白水平发生变化，可能与生物合成途径、视黄醇代谢途径等过程中CYP1A1、MT-1、ENO3、TAP1m RNA与蛋白水平变化有关。

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基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(82204701); 河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20190274); 中华医学会临床药学分会吴阶平基金会专项科研基金课题(LCYX-Q025);

文章来源:聂安政,边猛,朱春胜,等.基于蛋白组学探讨细辛水提物诱发肝损伤的作用机制[J].中草药,2024,55(15):5145-5153.