咳嗽根据持续时间分为急性咳嗽、亚急性咳嗽和慢性咳嗽[1]。感冒后咳嗽(post-infectious cough, PIC)是由上呼吸道病毒感染引起的亚急性咳嗽。气道炎症、氧化应激、气道高反应性和气道重塑是PIC发病的主要原因[2]。

苏黄止咳胶囊由晁恩祥教授根据其“风咳”理论和临床实践总结的经验方研发而成，组方包括蜜炙麻黄、紫苏叶、五味子等9种中药。苏黄止咳胶囊是目前临床上唯一治疗PIC和咳嗽变异型哮喘(cough variant asthma, CVA)的中成药[3]。课题组前期对苏黄止咳胶囊改善CVA、PIC、痰阻塞和气道重塑的药效和机制[4-9],以及其化学成分、药材、指纹图谱及质量控制等进行了研究[10-13]。五味子醇甲是从苏黄止咳胶囊的臣药五味子中分离得到的已知的主要木脂素类成分。研究发现五味子醇甲可通过调节MAPK和caspase-3信号通路抑制对乙酰氨基酚诱导的炎症和氧化应激，发挥肝保护作用[14];还可通过抑制氧化应激降低心肌缺血/再灌注导致的心肌凋亡[15]。虽然五味子醇甲具有抗炎、抗氧化药理活性，但其对PIC的作用还未有报道。为了解五味子醇甲在苏黄止咳胶囊中的作用，本研究建立PIC体内外模型，探讨五味子醇甲对PIC的止咳作用及机制，以期阐明五味子醇甲可能是苏黄止咳胶囊的主要功效成分。

1、材料

1.1 动物

SPF级ICR小鼠，雄性，体质量18～22 g, 购自江苏省扬州大学动物实验中心[实验动物生产许可证号SCXK(苏)2017-0007],饲养于中国药科大学实验动物中心[实验动物使用许可证号SYXK(苏)2021-0011],温度25 ℃,12 h昼夜循环，自由获取水及食物。实验设计及操作均严格按照中国药科大学动物伦理委员会的要求进行，动物伦理经中国药科大学科学技术处审批通过(伦理号2022-03-036)。

1.2 细胞株

人支气管上皮细胞BEAS-2B,购自中国科学院上海细胞库。

1.3 试剂与药物

苏黄止咳胶囊(批号21032111)由扬子江药业集团北京海燕药业有限公司提供；五味子醇甲对照品(批号DSTDW001001)部分购自成都德思特生物技术有限公司，部分由实验室自制；孟鲁司特纳片(批号T029242)购自杭州默沙东制药有限公司。香烟(批号6901028315562)购自红塔烟草(集团)有限责任公司；脂多糖(LPS,批号L2880)购自美国Sigma公司；辣椒素(批号B20693-20mg)购自上海源叶生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号P0011)、活性氧(ROS)生化试剂盒(批号S0033S)均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；小鼠白介素-1β(IL-1β,批号69-21178)、白介素-6(IL-6,批号69-99854)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α,批号69-99985)、丙二醛(MDA,批号69-21068)、ROS(批号69-21262)、超氧化物歧化酶(SOD,批号69-30017)、谷胱甘肽(GSH,批号59-20042)ELISA试剂盒均购自武汉默沙克生物科技有限公司；DMEM培养基(批号01-056-1A)购自以色列Biological Industries公司；胎牛血清(批号BC20220510)购自南京森贝伽生物科技有限公司；青霉素-链霉素溶液(批号5741I615FA0002)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Fibronectin(批号ab45688)、α-SMA(批号ab124964)抗体均购自英国Abcam公司；E-cadherin(批号3195T)、Vimentin(批号5741)、PI3K(批号4257)、p-PI3K(批号4228)、Akt(批号4691)、p-Akt(批号4060)、p-ERK(批号4370)、SIRT1(批号9475)抗体、兔二抗(批号7074S)、鼠二抗(批号7076S)均购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH(批号HRP-6004)、ERK(批号1643-1-AP)、NOX4(批号7681-1-Ig)抗体均购自美国Proteintech公司。

1.4 仪器

DMi8型倒置显微镜、DMi 1型荧光显微镜(德国Leica公司);Tanon 2600型凝胶成像仪(上海天能科技有限公司);实时荧光定量仪(美国赛默飞公司);M491型酶标仪(美国BioTek公司);电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司);超纯水系统(美国Millipore公司);细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱(美的集团股份有限公司);恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);移液枪(德国Eppendorf公司)。

2、方法

2.1 动物分组、造模及给药

60只ICR小鼠随机分为对照组、模型组、苏黄止咳胶囊组(14 g/kg)、孟鲁司特钠组(阳性对照，3 mg/kg)和五味子醇甲低、高剂量组(10、30 mg/kg),每组10只。除对照组外，其余各组小鼠于造模第1天通过气管滴注给予LPS生理盐水溶液(3 mg/kg);于造模第8天开始，将小鼠置于0.2 m3的自制烟室中，点燃6支固定品牌香烟烟熏，每次30 min, 每天2次，连续30 d。从造模第16天开始，各组灌胃给药，连续15 d, 对照组和模型组给予等量生理盐水。

2.2 细胞培养

BEAS-2B细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基培养，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰酶消化后接种于6孔板，分为对照组、模型组、苏黄止咳胶囊组和五味子醇甲低、高浓度组。待细胞生长至60%左右，除对照组外，各孔均给予LPS(终质量浓度10 μg/mL)处理，五味子醇甲低、高浓度组分别给予五味子醇甲溶液(终浓度3、10 μmol/L)处理，苏黄止咳胶囊组给予苏黄止咳胶囊混悬液(终质量浓度10 μg/mL)处理，细胞于37 ℃培养24 h。

2.3 咳嗽次数及咳嗽潜伏期测定

末次给药4 h后，用雾化器雾化辣椒素溶液，引发小鼠咳嗽。记录小鼠第1次咳嗽的时间，为咳嗽潜伏期，并记录3 min内的咳嗽次数。

2.4 HE染色和Masson染色观察小鼠肺组织病理学变化

处死小鼠，立即分离出肺组织，右肺中叶于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，制备4 μm组织切片，进行HE染色和Masson染色，于光学显微镜下观察肺组织病理变化，并对图像结果进行分析。

2.5 ELISA法检测肺组织炎症因子和氧化应激水平

取小鼠右肺下叶组织适量，匀浆，制成10%肺组织匀浆液，离心后取上清，采用BCA法测定总蛋白浓度，按ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、MDA、SOD、GSH水平与相应总蛋白表达的比值，即为相对值。

2.6 Westen blot法检测小鼠肺组织及BEAS-2B细胞中各目的蛋白表达

取小鼠右肺上叶组织适量，加入预冷的含PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA(中)裂解液充分匀浆，离心后取上清，采用BCA法测定蛋白浓度；于6孔板中加入预冷的PBS缓冲液清洗后，加入含PMSF和磷酸酶抑制剂的预冷RIPA(弱)裂解液，制备各组BEAS-2B细胞的蛋白样品。组织或细胞样品经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影等过程后得到目的蛋白条带，通过Image J软件分析条带灰度值，计算各目的蛋白相对表达。

2.7 RT-qPCR法检测BEAS-2B细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达

提取BEAS-2B细胞总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,并根据试剂盒说明书，使用Step One实时PCR系统进行PCR反应。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.8 ROS水平检测

于6孔板中加入PBS缓冲液清洗后，按照ROS试剂盒说明书检测BEAS-2B细胞内ROS生成，使用荧光倒置显微镜进行拍照，通过Image J软件分析得到相对荧光强度值。

2.9 统计学分析

通过GraphPad Prism软件进行处理，数据以

表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠咳嗽症状的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠咳嗽次数增加(P<0.01),咳嗽潜伏期缩短(P<0.01);与模型组比较，各给药组小鼠咳嗽次数均减少(P<0.01),咳嗽潜伏期均延长(P<0.01)。

3.2 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织病理变化的影响

如图2所示，HE染色显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织被大量炎性细胞浸润；与模型组比较，各给药组均可减弱肺组织炎性细胞浸润。Masson染色显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织呈现胶原沉积；与模型组比较，各给药组均可改善胶原沉积现象。

图1 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠咳嗽症状的影响

图2 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织病理变化的影响(×200)

3.3 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织炎症反应的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01);与模型组比较，除五味子醇甲低剂量组对TNF-α的抑制作用不明显外(P>0.05),其余各组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01)。

3.4 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织氧化应激的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织ROS、MDA水平均升高(P<0.01),SOD、GSH水平均降低(P<0.01);与模型组比较，除了五味子醇甲低剂量组对MDA抑制作用不明显外(P>0.05),其余各组ROS、MDA水平均降低(P<0.01),SOD、GSH水平均升高(P<0.01)。

图3 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织炎症反应的影响

图4 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织氧化应激的影响

3.5 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠气道重塑的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达降低(P<0.01),Fibronectin、Vimentin、α-SMA蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲高剂量组、苏黄止咳胶囊组和孟鲁司特纳组小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01),Fibronectin、Vimentin、α-SMA蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),五味子醇甲低剂量组E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白表达无明显变化(P>0.05),α-SMA蛋白表达降低(P<0.01)。

图5 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠气道重塑的影响

3.6 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠肺组织SIRT1/ERK信号通路的影响

有研究发现，ERK信号在慢性炎症和细胞因子表达调控中发挥重要作用，而SIRT1可以负性调节ERK[16-17]。如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织SIRT1蛋白表达降低(P<0.01),p-ERK蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲高剂量组、苏黄止咳胶囊组和孟鲁司特纳组小鼠肺组织SIRT1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),p-ERK蛋白表达降低(P<0.01)。

图6 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠SIRT1/ERK信号通路的影响

3.7 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠PI3K/Akt/NOX4信号通路的影响

PI3K/Akt信号通路被证明与氧化应激相关[18]。NOX4作为ROS的直接来源受到Akt的调控[19-20]。如图7所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织p-PI3K、p-Akt和NOX4蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，除了五味子醇甲低剂量组对NOX4蛋白表达的抑制作用不明显外(P>0.05),其余各组小鼠肺组织p-PI3K、p-Akt和NOX4蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01)。

图7 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对PIC小鼠PI3K/Akt/NOX4信号通路的影响

3.8 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症因子mRNA表达的影响

如图8所示，与对照组比较，模型组BEAS-2B细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达升高(P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲各浓度组和苏黄止咳胶囊组BEAS-2B细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达均降低(P<0.05,P<0.01)。

图8 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对BEAS-2B细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达的影响

3.9 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对LPS诱导的BEAS-2B细胞ROS水平的影响

如图9所示，与对照组比较，模型组BEAS-2B细胞ROS水平升高(P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲各浓度组和苏黄止咳胶囊组BEAS-2B细胞ROS水平均降低(P<0.05,P<0.01)。

图9 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对BEAS-2B细胞ROS水平的影响

3.10 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对LPS诱导的BEAS-2B细胞SIRT1/ERK信号通路的影响

如图10所示，与对照组比较，模型组BEAS-2B细胞SIRT1蛋白表达降低(P<0.05),p-ERK蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲低浓度组SIRT1、p-ERK蛋白表达无明显变化(P>0.05),五味子醇甲高浓度组和苏黄止咳胶囊组BEAS-2B细胞SIRT1蛋白表达升高(P<0.01),p-ERK蛋白表达降低(P<0.01)。

图10 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对BEAS-2B细胞SIRT1/ERK信号通路的影响

3.11 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对LPS诱导的BEAS-2B细胞PI3K/Akt/NOX4信号通路的影响

如图11所示，与对照组比较，模型组BEAS-2B细胞p-PI3K、p-Akt、NOX4蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，五味子醇甲低浓度组p-PI3K、p-Akt、NOX4蛋白表达无明显变化(P>0.05),五味子醇甲高浓度组和苏黄止咳胶囊组BEAS-2B细胞p-PI3K、p-Akt、NOX4蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01)。

图11 五味子醇甲及苏黄止咳胶囊对BEAS-2B细胞PI3K/Akt/NOX4信号通路的影响

4、讨论

PIC作为常见的呼吸系统疾病，由呼吸道病毒感染引发[2]。苏黄止咳胶囊作为治疗PIC唯一被批准的中成药，已在临床上取得了令人满意的治疗效果[21]。五味子醇甲具有抗炎、抗氧化等活性，在五味子和苏黄止咳胶囊中含量较高，但是它能否治疗PIC及其机制并未报道。因此本研究初步探讨五味子醇甲对PIC的改善作用及其机制。

炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α可通过改变肺泡上皮细胞的通透性引起炎性细胞浸润，进而导致肺组织损伤[22]。本研究发现，五味子醇甲在体内外均能有效地抑制炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α表达，表明五味子醇甲能减轻PIC小鼠肺部炎症。SIRT1是一种高度保守的NAD+依赖性去乙酰化酶，通过使蛋白去乙酰化调节包括炎症在内的多个生物学过程[23]。ERK是MAPK家族的一员，参与调节多种炎症反应。研究表明，穿心莲内酯可通过抑制SIRT1/ERK信号通路来减轻香烟烟雾提取物刺激诱导的巨噬细胞的氧化应激损伤[16]。本研究发现，五味子醇甲能够升高SIRT1蛋白表达，而降低磷酸化ERK蛋白表达。研究表明，氧化应激与多种呼吸系统疾病的发病机制有关，如急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、哮喘等[24]。PI3K/Akt信号通路是参与细胞代谢、生长、增殖的关键信号通路，也被证明与氧化应激相关[18]。NADPH氧化酶家族是各种病理条件下ROS的主要来源，由7个同工酶组成，包括NOX1-NOX5、DUOX1和DUOX2,其中NOX4在人肺上皮细胞中广泛表达[19]。已有研究证明NOX4受PI3K/Akt信号通路的调控[20]。本研究发现，五味子醇甲能抑制PI3K/Akt/NOX4信号通路表达，减少ROS的产生。此外，一些生物标志物也被发现与氧化应激相关，其中MDA是脂质过氧化氢的终产物，SOD是一种将O2-还原为过氧化氢的催化酶，GSH能催化过氧化氢和其他过氧化物的还原[25]。本研究发现，五味子醇甲能升高SOD和GSH水平，降低MDA水平，进一步证明了其抗氧化能力。香烟烟雾可引起气道重塑，上皮间充质转化在气道重塑中发挥重要作用[26]。本研究发现，PIC小鼠出现了明显的气道重塑表型，具体表现为PIC小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达降低，Fibronectin、Vimentin和α-SMA蛋白表达增加；五味子醇甲给药后，明显改善了PIC小鼠肺组织胶原蛋白沉积，且E-cadherin蛋白表达升高，Fbronectin、Vimentin和α-SMA蛋白表达降低，表明五味子醇甲可改善PIC小鼠的气道重塑。

综上所述，五味子醇甲可通过调节SIRT1/ERK信号通路抑制炎症，通过调节PI3K/Akt/NOX4信号通路抑制氧化应激，从而发挥改善PIC的作用。同时，本研究首次发现苏黄止咳胶囊能调控以上2条信号通路起到改善PIC的作用。由此推测，五味子醇甲是苏黄止咳胶囊中止咳的主要功效成分之一。

参考文献:

[3]张洪春,赵丹,晁燕,等.从苏黄止咳胶囊的研发探讨中药新药选题思路[J].中药新药与临床药理,2009,20(5):485-487.

[8]郭超,童希洋,秦伟伟,等.苏黄止咳胶囊改善哮喘豚鼠气道重塑的作用及其机制[J].中成药,2021,43(4):893-901.

[10]李舒丰,刘芹燕,刘文东,等.苏黄止咳胶囊及其挥发油中间体中挥发性成分的分析[J].中成药,2017,39(11):2329-2334.

[11]刘芹燕,巫兴东,陈东,等.苏黄止咳胶囊中非挥发性成分的LC-MS分析[J].中成药,2019,41(6):1434-1445.

基金资助:国家自然科学基金项目(32070356);

文章来源:吴楠,白子玉,欧永玉,等.苏黄止咳胶囊中五味子醇甲对感冒后咳嗽的改善作用[J].中成药,2024,46(08):2562-2571.