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分析我国三个城市未接受抗病毒治疗的部分HIV感染者治疗前耐药状况

2020-08-31 283 上传者：管理员

摘要：目的分析我国三个城市未接受抗病毒治疗(ART)的部分1型艾滋病病毒(HIV-1)感染者治疗前耐药(PDR)发生率及位点突变情况。方法收集2018年3-7月上海市公共卫生临床中心,南京市第二医院及云南省传染病专科医院未曾接受ART的HIV-1感染者血浆标本167例,采用巢式聚合酶链式反应扩增HIV-1高度保守序列pol基因中反转录酶/蛋白酶和整合酶区域,测序结果与美国斯坦福大学耐药数据库(http://fahf293ca6e07ec741b2902fdef5cfe995d5hqoxcpoq9oq0x6bxv.fyay.oca.swupl.edu.cn)进行序列比对。结果 167例扩增基因中PDR发生率为4.8%。非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)耐药发生率为2.4%,主要突变位点为K103N, Y181C。核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)耐药发生率为0.6%,主要突变位点为L210W。整合酶抑制剂(INSTIs)耐药发生率1.8%,主要突变位点为R263K。上海地区PDR总发生率为9.0%,南京地区为2.1%,本研究未检出昆明地区PDR发生。结论上海地区PDR发生率远高于其他两地区,应参考PDR结果为患者制定更精准的抗病毒治疗方案。

关键词：
发病机制
基因突变
抗病毒治疗
治疗前耐药
艾滋病病毒
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1型艾滋病病毒（HIV-1）耐药毒株的传播存在巨大风险[1],HIV感染者在启动抗病毒治疗（ART）前即存在耐药的现象被称为治疗前耐药（pre-treatment drug resistance,PDR)[2]。PDR发生率在不同的国家或地区表现不同[3,4,5],PDR人群若不及早检测发现，更换方案，会严重影响抗病毒一线疗法的长期效果。因此PDR的监测对一线ART方案的选择和疗效评估至关重要。2003年起，我国陆续开展艾滋病免费诊疗工作[6]，一线抗病毒方案为两种核苷类反转录酶抑制剂（NRTIs）联合一种非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）或者蛋白酶抑制剂（PIs）或整合酶抑制剂（INSTIs)[7]。目前，我国有关HIV-1治疗前耐药的报道主要包括NNRTIs,NRTIs以及PIs。本文基于一项多中心的随机对照研究实验（NCT02945163），对我国三个城市新发现、尚未启动ART的部分HIV-1感染者进行反转录酶、蛋白酶和整合酶的HIV-1 PDR发生率检测，旨在了解我国不同地区HIV-1 PDR基因突变状况及耐药发生情况，为我国艾滋病抗病毒治疗策略的制定提供依据。

1、材料与方法

1.1对象

上海市公共卫生临床中心，南京市第二医院及云南省传染病专科医院（昆明）年龄在18～60岁，经HIV-1抗体酶联免疫吸附试验法（ELISA）初筛并经我国疾病控制预防中心蛋白印迹试验（WB）确认HIV-1阳性者。本研究经上海市公共卫生临床中心伦理委员会批准（批件编号：2016-S054-01），所有受试者均签订知情同意书。

1.2方法

1）样本收集及核酸抽提：2018年3-7月期间，从上述3个地区同时收集未经ART的HIV-1感染者血浆标本进行横断面研究。入组受试者均为中华人民共和国国籍，既往均未接受过抗反转录病毒治疗及暴露前后预防。

使用EDTA抗凝采血管收集受试者全血标本，24h内分离血浆置-80℃冰箱保存，外地标本通过冷链干冰运输运送至上海市公共卫生临床中心，运输过程中严格检测温度，避免标本反复冻融。采用病毒核糖核酸（RNA）抽提试剂盒（Qiagen,德国）参考产品说明书取140μL血浆标本进行病毒RNA抽提。抽提完成后使用Nanodrop 2000/2000C分光光度计（Thermo,美国）测定RNA浓度并根据260/280值确定核酸纯度。

2）巢式聚合酶链式反应（PCR）及基因测序：采用巢式PCR，针对高度保守序列pol基因反转录酶/蛋白酶区和整合酶区分别进行扩增，扩增引物详见表1，反应体系详见表2，扩增反应条件为：第一轮：50℃反转录30min;94℃预变性2min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,40次循环；72℃延伸8min;4℃保温。第二轮：94℃预变性2min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,40次循环；72℃延伸8min;4℃保温。将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小确定后进行脱氧核糖核酸（DNA）纯化并送至苏州金唯智公司测序，测序引物分别使用第二轮PCR中正义链引物。使用斯坦福大学HIV耐药数据库(http://fahf293ca6e07ec741b2902fdef5cfe995d5hqoxcpoq9oq0x6bxv.fyay.oca.swupl.edu.cn/）对测序结果进行序列比对，并根据斯坦福网站评分标准将HIV-1对每种抗反转录病毒药物的耐药程度分为5个等级：敏感、潜在低度耐药、低度耐药、中度耐药和高度耐药，计算低度以上耐药率并分析不同扩增区域的耐药相关突变特点。

表1巢式PCR扩增引物及片段长度

表2巢式PCR两轮反应体系

1.3统计分析

使用SPSS 23.0版（IBM,美国）对所有数据进行统计分析。耐药率只计入低度以上耐药。通过Kolmogorov-Smirnov检验评估数据的正态分布情况。符合正态分布的数据描述为（平均数±标准差）（χ±SD）并使用t检验进行比较；非正态分布数据描述为中位数（四分位数区间）并使用Mann-Whitney U检验进行比较。分类变量使用卡方检验（χ2）或Fisher精确检验比较。Logistic逻辑回归分析用于识别与PDR相关的风险因素。所有测试均为双尾，P<0.05认为有显著性差异。

2、结果

2.1受试者一般特征

本研究共招募受试者167例，均获得了反转录酶/蛋白酶区和整合酶区基因序列。所有受试者中，男性感染者占比为92.8%(155例），女性占比为7.2%(12例）。年龄中位数为29岁，CD4+T淋巴细胞（简称CD4细胞）中位数为289.5个/µL，中位CD4/CD8细胞比值为0.29；病毒载量中位数为4.47 Log10拷贝/mL。167例受试者中，上海，南京，昆明三个城市分布情况及占比分别为：78例（46.7%),48例（28.7%),41例（24.6%）。

2.2 PDR总体情况

扩增成功的167例样本中，PDR发生率为4.8%(8例）。8例HIV-1 PDR感染者中，针对NNRTIs发生耐药突变有4例，总耐药发生率为2.4%(4例），主要突变位点为K103N(2例），Y181C(2例）。4例发生NNRTIs的患者中，高度耐药主要集中在奈韦拉平（NVP）和依非韦伦（EFV）两种药物，其中两例表现为对NVP和EFV均耐药，2例表现为NVP高度耐药；中度耐药2例，均表现在EFV，依曲韦林（ETR），利匹韦林（RPV）三种药物共同耐药，且两例中度耐药感染者同时有高度耐药突变。发生NRTIs耐药1例，耐药发生率为0.6%(1例），主要突变位点为L210W，表现为齐多夫定（AZT）低度耐药。3例发生INSTIs耐药，耐药发生率为1.8%(3例），主要突变位点为R263K，中度耐药集中表现为多替拉韦（DTG），艾维雷韦（EVG）以及比克替拉韦（BIC）。低度耐药主要表现为拉替拉韦（RAL）。本研究中无PIs PDR发生。

2.3各地区PDR情况分析

主要突变类型及各地区PDR基因突变率见表3，各地区耐药突变情况差异无统计学意义。此外，分析了HIV-1对17种常用抗病毒药物的耐药水平，其中高度耐药主要表现在EFV（频数n=2）和NVP(n=4）。中度耐药表现在EFV(n=2),ETR(n=2),RPV(n=2),BIC(n=3),DTG(n=3),EVG(n=3），低度耐药表现在AZT(n=1）和RAL(n=3）。

表3各类型药物突变情况及突变位点分布

将是否发生PDR作为因变量，以性别、年龄、CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值和病毒载量（Log10拷贝/µL）作为自变量，进行Logistics多因素回归分析。结果显示，在以上自变量中，未发现有统计学意义的风险因素（表4）。

表4 HIV-1治疗前耐药风险因素分析

3、讨论

本研究针对我国部分地区PDR流行病学水平进行检测调查，结果显示，我国上海、南京、昆明的PDR总发生率为4.8%，以NNRTIs耐药突变为主要突变形式。参考世界卫生组织发布的HIV耐药指南，我国南部地区NNRTIs PDR发生率仍处于低水平流行状态（<5%)[8]。在NNRTIs耐药突变位点中，Y181C和K103N为主要突变位点，这与既往研究结果一致[9]。而NVP由于其具有较低的遗传屏障因此更易产生高度耐药[10]。

本研究发现的INSTIs相关PDR全部出现在上海地区，突变率为3.8%，突变比例在所有药物类型中位居第二，该结果高于我国2019年云南省报道的INSTIs PDR发生率（1.8%)[11]，但由于样本量不足，本研究中未检测到云南地区INSTIs PDR发生。同时，结果高于2016年台湾地区报道的INSTIs PDR发生率（0.6%)[12]以及本实验中南京地区数据。此外，本研究报道的INSTIs PDR发生率也高于欧洲一些国家或地区[13,14,15,16]。由此看来，上海地区的INSTIs在我国已处于相对较高的水平。在我国，整合酶抑制剂还未完全推广，目前只有部分地区或经济较好的感染者在自费使用，且由于本研究中样本数较少，无法科学的分析INSTIs的风险因素。本研究的结果提示，尽管INSTIs在我国还未完全普及，但PDR在上海地区已经出现，在使用INSTIs之前，有必要进行INSTIs相关的PDR筛查，以确定用药方案。

不同地区的PDR发生率与突变特点有所不同。尽管未达到统计学差异，但上海地区PDR发生率有高于南京地区和云南地区趋势，应引起高度重视。究其原因，可能与上海地域开放，经济水平较高且人口流动性较大相关,且不排除有传播型耐药的可能性。

本研究存在一定的局限性：1）总样本数较小，特别是南京地区和昆明地区样本量只有上海地区的1/2，无法充分代表这两个地区的PDR情况；2）未收集患者的传播途径信息；3）本研究中男性受试者偏多，在样本选择上存在选择偏倚,在今后研究中应将性别作为平衡指标进行入组；4）因无法判知分析在PDR感染者中传播型耐药所占比例，在入组受试者收集信息时未对传播型耐药进行监测，今后研究中应对基线数据进行更加全面细致地收集。

综上，本研究报道了我国3个省市HIV-1感染者NNRTIs,NRTIs,PIs以及INSTIs相关的PDR突变情况，发现NNRTIs耐药目前仍为我国治疗前耐药中存在的主要耐药情况。INSTIs的PDR发生率在上海地区已有出现且处于相对较高水平。提示，未启动ART的HIV-1感染者在选择用药前进行HIV-1耐药性常规检测十分必要，参照PDR检测结果可为患者制定更精准的抗病毒治疗方案。

参考文献：

[7]中华医学会感染病学分会艾滋病丙肝学组,中国疾病预防与控制中心.中国艾滋病诊疗指南(2018版)[J].中国艾滋病性病,2018,24(12):1266-1282.

[11]邓雪媚,刘家法,张米,等.云南省HIV/AIDS病人原发性整合酶基因耐药突变情况[J].中国艾滋病性病, 2019,25(4):327-330.

荀静娜,陈蓉,陈军,魏洪霞,谢荣慧,王珍燕,唐琪,张仁芳,刘莉,卢洪洲.三个城市部分HIV感染者抗病毒治疗前耐药状况调查[J].中国艾滋病性病,2020,26(08):805-808.

基金:国家“十三五”科技重大专项(2017ZX09304027,2017ZX10202101);上海市公共卫生临床中心院级科研课题面上项目(KY-GW-2019-13)