肝胆外科手术操作复杂、手术时间长、术后多需留置引流管等,易并发各种吻合口瘘、引流管阻塞等引起继发感染,严重者可致多器官功能衰竭,危及生命。目前临床确诊感染主要根据病原体培养结果,但培养耗时长,影响早期治疗[1]。序贯器官衰竭评分(sequentialorganfailureassessment,SOFA)、急性生理和慢性健康状况评估Ⅱ(acutephysiologyandchronichealthevaluationⅡ,APACHEⅡ)评分虽可用于预后评估,但评价项目多、易受评价者主观因素影响[2]。降钙素原(procalcitonin,PCT)对临床诊断感染性疾病有重要价值[3]。Janus激酶(Januskinase,JAK)1、JAK2参与、调控机体炎性反应及免疫反应等过程,其异常表达可能与感染有关[4]。循环游离DNA(circulatingfreeDNA,cf-DNA)是中性粒细胞抵抗病原体侵袭过程中释放的免疫活性物质,外周血cf-DNA表达可反映机体免疫状态[5]。本研究观察行肝胆外科手术治疗患者术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达变化,探讨其在肝胆外科手术后感染早期诊断中的价值,报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2017年5月—2020年1月攀枝花市中心医院行肝胆外科手术后7d发生感染患者74例为感染组,其中表浅手术切口感染49例,深部手术切口感染16例,器官或腔隙感染9例。入选标准:(1)经临床确诊为急性胆囊炎、胆总管结石、肝内胆管结石,符合手术治疗指征;(2)依据文献[6],符合以下3项中任意2项诊断为感染:病原体检测阳性;外周血白细胞计数≥10×109/L;体温≥38℃或<36℃,持续48h以上;(3)年龄25～59岁;(4)临床资料完整。排除标准:(1)入组前已存在感染性疾病者;(2)术后发生非手术相关感染如呼吸道感染、肠源性感染等者;(3)有免疫系统缺陷者;(4)恶性肿瘤患者。另选取性别、疾病种类相匹配的,同期行肝胆外科手术后7d未发生感染者74例为未感染组,均未合并免疫系统缺陷、恶性肿瘤,临床资料完整。本研究经攀枝花市中心医院伦理委员会批准通过,研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床资料收集

收集2组临床资料,包括年龄、性别、体质量指数、合并基础疾病(高血压、高脂血症、冠心病)情况、手术方式、手术类型、手术时间。

1.2.2外周血JAK1、JAK2、PCT水平检测

分别于术前1d、术后1d清晨采集2组空腹肘静脉血4mL,分为2份。取1份血标本,离心半径8cm,3500r/min离心15min取上层血清,采用ELISA法检测JAK1、JAK2、PCT水平。JAK1、JAK2检测试剂盒由上海康泰生物技术有限公司提供,PCT检测试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供,均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3外周血cf-DNA表达检测

取另1份血标本,置于肝素抗凝管,离心半径8cm,4000r/min离心5min,取上清1mL置EP管,液氮保存。按照南京建成生物有限公司游离DNA提取试剂盒说明书步骤提取cf-DNA,样本分装,置液氮保存。应用实时荧光定量PCR仪(美国ThermoFisher公司)检测cf-DNA表达。反应体系:SYBRGreenⅠMaster荧光染料10μL,上下游引物混合物1μL,模板DNA1μL,无菌ddH2O补足至20μL。反应条件:预变性95℃30s,变性95℃5s,退火60℃20s,延伸72℃20s(共40个循环);64℃～95℃采集荧光绘制溶解曲线,PCR仪自带软件完成溶解曲线分析,记录对应cf-DNA表达。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。上游引物序列:TH-GAPDH-F:5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3',下游引物序列:TH-GAPDH-R:5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.2.4SOFA评分、APACHEⅡ评分判定及感染组亚组分组方法

术后1d评定感染组和未感染组SOFA评分、APACHEⅡ评分。感染组患者以SOFA评分均值、APACHEⅡ评分均值为界,分为高SOFA评分(SOFA评分≥8分)组45例和低SOFA评分(SOFA评分<8分)组29例,高APACHEⅡ评分(APACHEⅡ评分≥19分)组47例和低APACHEⅡ评分(APACHEⅡ评分<19分)组27例。

1.3统计学处理

应用SPSS21.0软件进行统计分析,正态分布计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,2组间比较采用独立样本t检验;计数资料比较采用χ2检验;Pearson相关法分析术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达与SOFA评分、APACHEⅡ评分的相关性;多因素logistic回归分析行肝胆外科手术患者术后发生感染的影响因素;绘制ROC曲线,评估术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA诊断肝胆外科手术后感染的价值;检验水准α=0.05。

2、结果

2.1感染组与未感染组一般资料比较

感染组年龄大于未感染组(P<0.05),合并高血压、高脂血症、冠心病比率高于未感染组(P<0.05);2组性别比例、体质量指数、手术类型、手术方式、手术时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1感染组与未感染组一般资料比较

2.2感染组与未感染组不同时间外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达比较

感染组术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达均高于未感染组(P<0.05),术前1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达与未感染组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2感染组与未感染组不同时间外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达比较

2.3肝胆外科手术患者术后发生感染影响因素的多因素logistic回归分析

以是否发生术后感染为因变量,年龄、合并基础疾病、外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA为自变量,纳入模型进行多因素logistic分析,结果显示年龄、合并基础疾病及术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA是肝胆外科手术患者发生术后感染的影响因素(P<0.05)。见表3-4。

表3变量赋值表

表4肝胆外科手术患者发生术后感染影响因素的多因素logistic回归分析结果

2.4术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA诊断肝胆外科手术后感染的ROC曲线分析

术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA分别以42.21ng/L、43.52ng/L、7.37μg/L、1.08mg/L为最佳截断值,诊断肝胆外科手术后感染的AUC分别为0.819(95%CI:0.748～0.878,P<0.001)、0.768(95%CI:0.692～0.833,P<0.001)、0.821(95%CI:0.749～0.879,P<0.001)、0.754(95%CI:0.677～0.821,P<0.001),灵敏度分别为77.03%、68.92%、70.27%、77.03%,特异度分别为79.73%、77.03%、78.38%、60.81%;4项指标联合检测诊断肝胆外科手术后感染的AUC为0.894(95%CI:0.833～0.939,P<0.001),灵敏度为77.03%,特异度为86.49%。见图1。

图1术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA诊断肝胆外科手术后感染的ROC曲线图

2.5感染组与未感染组术后1dSOFA评分、APACHEⅡ评分比较

感染组术后1dSOFA评分、APACHEⅡ评分高于未感染组(P<0.05)。见表5。

表5感染组与未感染组术后1dSOFA评分、APACHEⅡ评分比较

2.6高、低SOFA评分组及APACHEⅡ评分组患者术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达比较

高SOFA、APACHEⅡ评分组术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达均高于低SOFA、APACHEⅡ评分组(P<0.05)。见表6-7。

表6高、低SOFA评分组患者术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达比较

表7高、低APACHEⅡ评分组患者术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达比较

2.7感染组术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA与SOFA、APACHEⅡ评分的相关性

感染组患者术后1d外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA与SOFA评分(r=0.747,r=0.712,r=0.663,r=0.804,P<0.001)和APACHEⅡ评分(r=0.864,r=0.568,r=0.544,r=0.633,P<0.001)均呈正相关。

3、讨论

感染是肝胆外科术后常见并发症之一,若未及时诊断并采取积极措施易导致多器官功能障碍,严重者危及患者生命。术后感染发生、发展与炎症及免疫反应密切相关[7,8],探讨早期诊断肝胆外科术后感染的炎症或免疫学指标有重要意义。

PCT是一种炎症介质,细菌感染时器官组织内巨噬细胞、单核细胞受刺激而大量生成PCT,其可作为鉴别全身炎症反应综合征的指标之一。PCT水平可早期预测重症急性胰腺炎患者病情进展、胰周感染情况[9]。本研究结果显示,感染组术后1d外周血PCT水平高于未感染组,提示外周血PCT可鉴别肝胆外科术后是否存在感染。但亦有研究[10]表明,外周血PCT在大手术、严重创伤等疾病中存在假阴性、假阳性。SOFA评分、APACHEⅡ评分是临床评估感染等危急重症患者病情的常用方法,评分越高提示病情越严重,器官组织受累范围越广。本研究结果显示,高SOFA评分组、高APACHEⅡ评分组外周血PCT水平分别高于低SOFA、APACHEⅡ评分组,PCT水平与SOFA评分、APACHEⅡ评分呈正相关,表明PCT作为器官组织严重损害时所产生的炎症介质,器官组织受累越严重,其水平越高,与SOFA、APACHEⅡ评分变化趋势一致,可为临床病情评估提供参考。

cf-DNA是中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophilextracellulartraps,NETs)的主要组成部分,而NETs参与机体免疫。外周血cf-DNA高表达表明机体免疫力强,但NETs在清除病原体的同时也会损伤机体组织[11]。有研究[12]表明,脓毒症患者血cf-DNA表达显著升高。本研究结果显示,感染组术后1d外周血cf-DNA表达高于未感染组,cf-DNA是肝胆外科术后发生感染的影响因素。分析原因:机体受病原体侵袭时启动免疫防御机制,中性粒细胞释放cf-DNA,但感染持续存在可造成免疫系统过度激活,对组织细胞造成病理性损伤[13];此外,cf-DNA大量释放可通过与组蛋白结合增加血小板活化,造成血液高凝状态,影响器官组织血液供应,继而引发多器官功能障碍,而感染持续存在,病原体增殖可诱发cf-DNA持续生成,形成恶性循环,其表达随SOFA评分、APACHEⅡ评分升高而升高[14]。本研究结果显示,外周血cf-DNA表达与SOFA评分、APACHEⅡ评分呈正相关,与上述研究结果[14]一致,提示cf-DNA可作为评估感染病情严重程度的指标。

JAK1/2是机体炎性反应及免疫反应主要调控通路之一,阻断多器官功能障碍大鼠JAK1/2通路后,外周血白细胞、中性粒细胞并未减少,提示JAK1/2参与器官功能损伤的过程[15]。张怡敏等[16]研究结果表明,鲍曼不动杆菌可通过JAK1/2通路活化血小板激活因子受体继而诱发支气管上皮细胞凋亡。本研究结果显示,感染组术后1d外周血JAK1、JAK2水平高于未感染组,JAK1、JAK2是肝胆外科术后发生感染的影响因素;高SOFA评分组、APACHEⅡ评分组外周血PCT水平高于低评分组,JAK1、JAK2水平与SOFA评分、APACHEⅡ评分均呈正相关,分析原因可能是感染激活细胞中JAK1/2通路,其水平越高表明器官组织损害越严重,与SOFA评分、APACHEⅡ评分变化趋势一致,提示JAK1、JAK2水平与患者病情进展密切相关。本研究结果显示,外周血JAK1、JAK2、PCT、cf-DNA联合检测诊断肝胆外科术后感染的AUC高于各指标单独检测,表明上述4项指标联合检测在肝胆外科术后感染早期诊断中有较高价值。

本研究结果提示,肝胆外科术后感染患者外周血JAK1、JAK2、PCT水平及cf-DNA表达升高,并与病情严重程度有关,4项指标联合在肝胆外科术后感染早期诊断中具有一定价值。但肝胆外科术后感染发生、发展的具体机制尚未明确,需进一步研究证实。

参考文献：

[1]刘悦,朱小亚,蒋析文.基于NGS的宏基因组学在微生物病原体鉴定中的应用[J].热带医学杂志,2019,19(11):1446-1449.

[2]周赛君,鲍剑虹,王逸平.血清神经元特异性烯醇化酶和急性生理与慢性健康评定量表Ⅱ评估心肺复苏后脑损伤预后的临床研究[J].中华神经科杂志,2018,51(2):124-126.

[3]朱孟沙,张贵英,赵清娟,等.Presepsin在脓毒症早期诊断和预后评估中应用价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(2):152-154.

[4]葛风,蒋云召,王泳,等.微小RNA-422b对胶质瘤细胞侵袭迁移和JAK1/STAT3通路的影响[J].临床肿瘤学杂志,2019,24(11):1004-1007.

[5]解鸿翔,许国莹,张巧云,等.中性粒细胞胞外诱捕网在抗磷脂综合征中的检测及形成机制的初步研究[J].中华风湿病学杂志,2019,23(8):524-529.

[8]徐健,余淼,申权,等.细菌感染与胰十二指肠切除术后胰瘘发生的相关性研究[J].中国实用医刊,2020,47(5):16-18.

[9]吴国刚,冷梅,刘兆润,等.C反应蛋白与降钙素原早期预测胰十二指肠切除术后胰瘘的临床价值[J].中华肝胆外科杂志,2017,23(12):827-831.

[10]王郝,崔娜,牛芳,等.降钙素原对心脏外科术后重症患者感染的早期预测价值[J].中华危重病急救医学,2017,29(10):897-901.

[12]孟强,屈峰,董伟,等.外周血游离DNA/NETs在脓毒症诊断和预后评估中的应用价值[J].中国呼吸与危重监护杂志,2018,17(3):255-258.

[14]陈广生,赵琳,何凤棣,等.重症急性胰腺炎cf-DNA/NETs､sTREM-1及GP-2α水平与病情关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(6):584-587.

[16]张怡敏,张宏方,周雪宁,等.鲍曼不动杆菌通过活化血小板激活因子受体引起感染人支气管上皮细胞的氧化应激和细胞凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志,2018,34(5):421-426.

高端,邢橙,魏秀容,杨楷,唐丽.外周血Janus激酶1和Janus激酶2与降钙素原及循环游离DNA早期诊断行肝胆外科手术患者术后感染的价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2021,35(03):284-289.

基金:四川省科技计划项目(2018JDR1358)