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全基因测序分析发现脑白质疏松患者NOTCH3基因的新突变

2021-04-14 466 上传者：管理员

摘要：目的：探究脑白质疏松(LA)患者基因突变情况。方法：选择我中心神经内科LA患者160例为LA组，同期神经内科健康体检者144例为对照组。LA组中选取11例接受全基因组测序，采用Sequenom-MassARRAY平台进一步验证所有入选者候选基因突变标记。结果：LA组年龄、脑卒中或短暂性脑缺血发作、高血压比例、同型半胱氨酸、肌酐、尿酸及尿素水平明显高于对照组(P<0.05,P<0.01)。11例LA患者进行全基因组测序，共确定9935469个突变，在这些突变后，最终得到6个LA的致病变异体，分别位于亚甲基四氢叶酸还原酶、脂肪酸2-羟化酶、NOTCH3、ABCD14个LA相关基因。在矫正年龄性别后，NOTCH3的rs1044055与LA有相关性(95%CI:0.454～0.893,P=0.008)。5例LA患者中发现一种新的突变(NOTCH3p.G1295R)。结论：NOTCH3是LA患者的候选风险基因。NOTCH3p.G1295R及MTHFRp.C212W是潜在的LA病因。

关键词：
单核苷酸
基因组
多态性
突变
脑白质疏松症
脑血管
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脑白质疏松(LA)是老年人常见的脑白质改变，约占整体人群的42.3%～100%[1,2,3]。尽管在发病初期脑白质改变可能是无症状的，但随着病情的进展可能出现认知功能损害、精神障碍、步态异常以及排尿功能障碍[4]。近年来大量的数据显示，LA相关的危险因素并不一致，并且LA的病因也并未阐明，如高龄、高血压、腔隙性脑梗死等，同卵双胞胎家系研究发现，遗传因素同样是LA的重要病因[5]。全基因组关联分析(GWAS)研究认定，许多LA相关的遗传风险位点，包括17q25,10q24,2p21等[6,7,8]。此外，一项基于GWAS研究的荟萃分析发现，另外的2个遗传风险位点(1q22、2p16)以及许多LA相关的提示性位点[9]。高通量测序技术为致病突变提供了可能性，本研究利用二代测序技术SequneomMassarray对11例LA患者的样本进行全基因组测序，以此筛查新的影响LA负荷的遗传变异。

1、资料与方法

1.1研究对象

选择2018年12月～2019年5月解放军总医院第七医学中心神经内科LA患者160例为LA组，男90例，女70例，平均年龄(73.59±10.52)岁。另选择同期于神经内科健康体检者144例为对照组，男77例，女63例，平均年龄(62.63±12.60)岁。排除标准：既往大血管脑卒中史、免疫性脑小血管病、神经退行性疾病、炎性及免疫介导的脑血管病、精神疾病等。本研究通过伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。

1.2一般资料的采集

收集入选者年龄，性别，既往脑卒中或短暂性脑缺血发作(TIA)病史等一般资料。用Sequenom-MassARRAY平台验证候选基因突变标记。收集影像学资料，LA头颅MRI表现为脑室周围或皮质下脑白质在T1WI上呈低信号，T2WI及T2液体衰减反转恢复上呈高信号。

1.3基因检测与分析方法

于LA组选取有明确影像学报告的11例不相关的LA患者进行全基因组测序，采用settleseq注释138注释变量(http://snp.gs.washington.edu/settleseqannotation138)及与注释相关的联合消耗(CADD),包括保护性状、功能类型、多表型评分、格兰瑟姆(Grantham)评分、CADD评分等。本研究只保留了DAVID生物信息学资源(v6.7)的功能变体和注释基因。具体流程如下：(1)11例患者确定所有突变(9935469个);(2)潜在的功能突变(93828个);(3)LA相关的基因突变(126个);(4)潜在的致病突变多表型评分>0.8,8个突变属于6个亚基，即亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、脂肪酸2-羟化酶(FA2H)、NOTCH3、ABCD1、GFAP、ANGPTL4。为减少候选基因的数量，本研究只保留了直接包含缺血性脑血管病、白质脑病、脑白质营养不良或同型半胱氨酸的基因注释。

选择标签单核苷酸多态性(SNP):将6个候选基因分别提交给HapMapPhaseⅡ+Ⅲ系统，最终得到了16个标签来代表这6个基因中的SNP。利用MassArray分析设计3.0软件(Sequenom)为16个标签和8个候选变异体设计位点特异性PCR和检测引物，并与LA组其他149例患者和对照组进行了基因分型。从随后的分析中删除了3个样本和2个缺失基因型超过5%的SNP。从分析中剔除6个小等位基因频率<0.05的SNP。对照组有1个SNP偏离Hardy-Weinberg平衡，通过手工检验聚类图验证为基因型错误。

采用Swiss-PdbViewer4.11分析MTHFR,p.V221M和NOTCH3,p.G1295R突变蛋白的局部结构[10]。采用Phyre对局部肽进行功能分析[11]。

1.4统计学方法

采用SPSS22.0软件，计数资料采用t检验。在Plink(v1.9)中应用以年龄和性别为协变量的logistic回归分析15个质量控制通过的SNP与LA性状之间的关联，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1LA组和对照组人口学特征比较

LA组年龄、脑卒中或TIA、高血压比例、同型半胱氨酸、肌酐、尿酸及尿素水平明显高于对照组，维生素B12明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,表1)。

表1LA组和对照组人口学特征比较

2.2验证候选突变

表211例LA患者的候选突变

由表2可见，在6种致病变异体中，NOTCH3p.G1295R和MTHFRp.V221M2个突变仅存在于LA组中；其他突变则可能分布在LA组或对照组，差异无统计学意义(P>0.05)。

5例LA患者中发现一种新的突变(NOTCH3p.G1295R),对照组未见此突变。11例LA患者进行全基因组测序，共确定9935469个突变。在这些基因突变后，最终得到6个LA的突变，均属于错义突变，分别位于4个LA相关基因，包括MTFHR,FA2H,NOTCH3,ABCD1。新发现的3个错义突变(未记录在dbSNP142中)均位于V$PAX5_02、V$ZIC3_01以及V$ARNT_01的已知转录因子结合位点。

2.3相关性分析

logistic回归分析发现，在矫正年龄性别后，NOTCH3基因的rs1044055与LA有相关性(P=0.008,表3)。

表3logistic回归分析

2.4基因突变对蛋白质结构影响的预测

通过Swiss-PdbViewer预测NOTCH3,p.G1295R和MTHFR,p.V221M对蛋白质结构的效果显示，G1295R位于NOTCH3的表皮生长因子样结构域，通过表皮生长因子样结构域类似物d1tpga1预测，在1295位氨基酸，非极性氨基酸突变为极性氨基酸；V221M位于MTHFR,3atpB的α螺旋并产生新的氢键，使221位能量从-37.205上升到-8.693(图1～2)。

功能分析发现，MTHFR的3atpB和NOTCH3的d1tpga1三级结构最为相似。

图1突变型异构体d1tpga1(含有NOTCH3,p.G1295R)图2突变蛋白3atpB的部分三级结构图1～2蛋白结构的效果红色为酸性氨基酸，蓝色为碱性氨基酸，黄色为极性氨基酸，灰色为非极性氨基酸，绿色虚线为氢键

3、讨论

脑小血管病变是LA的常见病因。高龄、高血压、高同型半胱氨酸血症是LA的危险因素[3,12]。在本研究中，LA组高血压比例、同型半胱氨酸、肌酐、尿酸、尿素水平明显高于对照组。然而，LA组较对照组糖尿病比例略低，无显著差异，与DelBene等[13]研究类似。但这些特征不能全部解释LA的血管危险因素，因LA病因非常复杂，由单核苷酸多态性与协变量主效应、基因-基因相互作用、基因-环境相互作用三部分组成。尽管许多基因都参与LA发病，但具体基因调节机制尚不明确[14]。

全基因组测序是研究遗传疾病的有力工具。本研究选择了有明确影像学报告的11例LA患者，得到9935469个变异体，其中明确6种致病突变，分别位于4类LA相关基因，包括MTHFR、FA2H、NOTCH3、ABCD1。本研究进一步在另外的LA组和对照组中复制了NOTCH3作为LA相关基因，揭示了p.G1295R可能参与了LA的发病机制。

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)是一种单基因遗传病与NOTCH3基因突变有关，以早发腔隙性脑梗死、皮质下痴呆、精神障碍和偏头痛为特征。本研究发现5例携带NOTCH3的新突变，p.G1295R为首次报告的LA致病性SNP。除1例有复发性脑梗死和家族性脑卒中史，其余4例无典型的CADASIL症状，提示可能存在潜在的非典型CADASIL。据报道，对于65岁腔隙性脑卒中和LA患者，CADASIL发生率为2.0%[15]。因此，本研究新发现的位点可提高LA不典型CADASIL诊断率。

本研究发现，NOTCH3p.G1295R,MTHFRp.V221M基因突变都是对蛋白质局部结构有害的突变，可能是导致LA突变的原因。以往研究发现，MTHFR的突变与血清同型半胱氨酸水平相关，这可能导致内皮细胞功能障碍和内皮来源的一氧化氮减少[16]。本研究对9个质量控制通过的SNP与LA性状进行了关联检验只发现了1个更显著的SNP(rs1044055),这表明LA是一种多基因疾病。因此，LA可能存在包括了不同种族、人群甚至家庭之间致病基因/等位基因的差异，导致基因座和等位基因的异质性。因此，要全面了解LA的遗传特质还有很多工作要做。

总之，本研究对11例LA患者进行全基因组测序，发现了NOTCH3中有1个非同义单核苷酸突变(p.G1295R),并用160例不相关的典型LA患者和对照组144例验证突变发现，有4例LA患者携带这种突变，而对照组中没有携带这种突变。更重要的是，本研究的发现首先集中在1个新的非同义单核苷酸突变(p.G1295R)与显性遗传LA相关，有助于加深对LA的认识，并为预防和治疗提供可能的途径。

参考文献：

[1]黄勇华,赵弘轶.脑小血管病研究新理念[J].中国现代神经疾病杂志,2019,19(7):461-465.

[15]石文磊,韩红梅,王国强,等.脑小血管病的遗传学研究进展[J].中华神经医学杂志,2017,16(2):204-208.

夏振西,石文磊,黄敏莹,刘宇,赵弘轶,高佳佳,尹维民,黄勇华.全基因测序分析发现脑白质疏松患者NOTCH3基因的新突变[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(04):340-343.