银屑病是一种炎症性皮肤疾病，其发病机制尚不明确，主要认为是由免疫细胞刺激角质形成细胞过度增殖，导致机体出现炎症性皮损[1]。西医治疗以药物为主，短期疗效显著但药物不良反应大，中药活性成分治疗银屑病具有药物不良反应小、来源广等优势[2]。青蒿素是中药青蒿中提取的主要活性成分，其衍生物双氢青蒿素可通过抑制角质形成细胞过度增殖，控制银屑病的发生[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种非编码RNA,在调节角质形成细胞过度增殖、凋亡及非典型免疫激活过程中起着关键作用[4]。本研究旨在分析青蒿素通过miR-129-5p、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ,CaMK4)轴介导信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription factor 3,STAT3)通路对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠的改善作用。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级C57BL/6雄性小鼠，鼠龄4～6周，体质量18～22 g, 购自山西医科大学实验动物中心。动物许可证号：SCXK(晋)2019-0004。本实验经山西医科大学第二医院伦理委员会批准(伦理批号：20230829)。

细胞人胚肾293T细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

药品与试剂青蒿素，规格：每瓶10 mg, 纯度：≥95.0%,批号：013F8K29065,上海源叶生物科技有限公司生产；甲氨蝶呤片，规格：每片2.5 mg, 批号：197221206,批准文号：国药准字H31020644,上海上药信谊药厂有限公司生产；5%咪喹莫特(imiquimodointment, IMQ)软膏，规格：每支3 g, 批号：19070140,批准文号：国药准字H20030129,四川明欣药业有限责任公司生产。兔抗鼠STAT3、兔抗鼠磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)、羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG),均由英国Abcam公司生产；CaMK4干扰质粒(siCaMK4)、miR-129-5p抑制物(miR-129-5p inhibitor)及其阴性对照(NC inhibitor),均由上海吉玛生物公司提供；miR-129-5p、CaMK4引物，均由上海生工公司合成；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒、扩增试剂盒、逆转录试剂盒，均由北京百奥莱博科技有限公司生产；双荧光素酶报告基因法试剂盒，上海圣尔生物科技有限公司生产；白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-23、IL-22酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均由上海烜雅生物科技有限公司生产；二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay, BCA)蛋白浓度测定试剂盒，北京天根生化科技有限公司生产。

仪器BX43荧光显微镜、IX51倒置显微镜，均为日本Olympus公司产品；PowerPacTM Basic电泳仪、Ge1Doc XR System凝胶成像仪，均为美国伯乐公司产品；MK3酶标仪，上海热力仪器有限公司产品；LightCycler 96实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polyme-rase chain reaction, qRT-PCR)仪，瑞士Roche公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]

用剃毛器将小鼠背部毛发剔除，裸露约2 cm×3 cm的皮肤，再用10% Na2S脱去剩余部位的毛发；第1天观察脱毛区有无红肿、破溃等异常反应；第2天起，每天均用5%咪喹莫特乳膏62.5 mg涂抹小鼠背部脱毛区，连续7 d, 若小鼠皮肤出现银屑病样改变，则建模成功。

2.2 动物分组与给药方法

将所有小鼠按随机数字法分为对照组、模型组、阳性对照组、实验组、miR-129-5p inhibitor组、siCaMK4组，每组10只。除对照组外，其余各组小鼠均构建银屑病小鼠模型。于造模完成后进行干预，阳性对照组给予1 mg·kg-1甲氨蝶呤灌胃，实验组给予100 g·mL-1青蒿素灌胃，miR-129-5p inhibitor组在实验组的基础上尾静脉注射miR-129-5p inhibitor,siCaMK4组在实验组的基础上尾静脉注射siCaMK4。对照组、模型组均灌胃等量0.9%NaCl, 每天1次，连续7 d。

2.3 qRT-PCR检测miR-129-5p和CaMK4 mRNA的表达水平[5]

按照试剂盒说明书提取各组小鼠皮损组织中的总RNA,逆转录合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和U6为内参，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增反应，用2-ΔΔCt法计算miR-129-5p和CaMK4的相对表达水平。

2.4 双荧光素酶报告基因法验证miR-129-5p与CaMK4的靶向关系[5]

通过ENCORI数据库预测miR-129-5p与CaMK4的结合序列，构建CaMK4-WT(野生型)、CaMK4-MUT(突变型)质粒，分别与NC inhibitor、miR-129-5p inhibitor共同转染293T细胞后，置于细胞培养箱中培养48 h, 加入裂解液，按照报告基因试剂盒说明书检测酶活性。

2.5 银屑病面积与严重性指数评分(psoriasis area and severity index, PASI)评估小鼠皮损情况[6]

于造模完成后的第3、5、7天，观察各组小鼠背部皮损变化情况，进行PASI评分。从红斑、鳞屑及增厚浸润程度3个维度进行，分为无、轻、中、重、极重5个程度，分别记为0～4分，三者计分相加为总分，总分0～12分，总分代表银屑病的严重程度。

2.6 ELISA法检测血清IL-17、IL-23和IL-22的水平[7]

取小鼠腹主动脉血4 mL,以4 000 r·min-1离心15 min, 分离血清，用相应的ELISA试剂盒检测小鼠血清IL-17、IL-23、IL-22水平。

2.7 蛋白质印迹(Western blot)法检测p-STAT3/STAT3蛋白的表达水平[7]

取小鼠皮损组织，加入裂解液提取总蛋白，按照BCA法进行蛋白质含量测定，经电泳、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭2 h, 加入p-STAT3(1∶1 000)、STAT3(1∶2 000)抗体稀释液4 ℃封闭过夜，洗涤3次，再加入辣根酶标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h, 洗涤3次，加入ECL显影，用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2.8 HE染色法检测皮损组织病理学变化[8]

用颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠背部皮损组织，用4%中性甲醛溶液固定，经乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片后晾干，于显微镜下观察各组小鼠皮损组织病理变化。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 小鼠皮肤组织HE染色

对照组小鼠正常饲养，模型组小鼠构建银屑病模型，阳性对照组在模型组的基础上给予1 mg·kg-1甲氨蝶呤，实验组在模型组的基础上给予100 g·mL-1青蒿素，miR-129-5p inhibitor组在实验组的基础上尾静脉注射miR-129-5p inhibitor,siCaMK4组在实验组基础上尾静脉注射siCaMK4。

图1用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组皮肤组织病理变化(×200)

HE染色结果显示：对照组小鼠表皮薄，皮下炎症细胞浸润少；模型组中表皮增厚、炎症细胞浸润；阳性对照组和实验组中表皮增厚程度均较模型组明显减少，炎症细胞浸润减轻。结果见图1。

2 青蒿素对银屑病皮肤组织中miR-129-5p、CaMK4 mRNA相对表达水平的影响

对照组、模型组、实验组的miR-129-5p相对表达水平分别为1.00±0.18、0.54±0.07和0.88±0.13,CaMK4 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.17、1.68±0.31和1.20±0.22。模型组与对照组相比，miR-129-5p相对表达水平明显降低，CaMK4 mRNA相对表达水平明显升高(均P<0.001);实验组与模型组相比，miR-129-5p相对表达水平明显升高，CaMK4 mRNA相对表达水平明显降低(均P<0.001)。

3 miR-129-5p靶向调控CaMK4表达

通过ENCORI数据库发现，CaMK4是miR-129-5p的靶向mRNA,二者间存在结合位点(见图2)。双荧光素酶实验结果显示：NC inhibitor组和miR-129-5p inhibitor组的CaMK4-WT水平分别为1.00±0.12和1.67±0.20,CaMK4-MUT水平分别为1.00±0.11和1.05±0.12。miR-129-5p inhibitor组与NC inhibitor组相比，CaMK4-WT 293T细胞的荧光素酶活性明显升高(P<0.001),但对CaMK4-MUT 293T细胞的荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。

4 青蒿素通过miR-129-5p/CaMK4轴改善银屑病样皮损

第3、5、7天，模型组与对照组相比，PASI评分均明显升高(均P<0.001);第5、7天，阳性对照组和实验组PASI评分均较模型组明显降低(均P<0.001);第5、7天，miR-129-5p inhibitor组与实验组相比，PASI评分均显著升高(P<0.01,P<0.001);第5、7天，siCaMK4组与实验组比较，PASI评分均显著降低(P<0.01,P<0.001)。结果见表1。

5 青蒿素通过miR-129-5p/CaMK4轴改善小鼠炎症水平

模型组中IL-17、IL-23和IL-22水平均较对照组明显升高(均P<0.001);阳性对照组、实验组与模型组相比，IL-17、IL-23和IL-22水平均明显降低(P<0.001,P<0.01);miR-129-5p inhibitor组与实验组相比，IL-17、IL-23和IL-22水平均显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而siCaMK4组中IL-17、IL-23和IL-22水平均较实验组显著降低(P<0.05,P<0.001)。结果见表2。

图2miR-129-5p与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMK4)间结合位点关系

表1各组皮损银屑病面积与严重性指数评分的比较

6 青蒿素通过miR-129-5p/CaMK4轴抑制STAT3磷酸化

如图3所示：对照组、模型组、阳性对照组、实验组、miR-129-5p inhibitor组和siCaMK4组的p-STAT3/STAT3比值分别为0.38±0.04、0.68±0.07、0.45±0.05、0.48±0.05、0.57±0.07和0.42±0.04。模型组与对照组相比，p-STAT3/STAT3比值明显升高(P<0.001);阳性对照组的p-STAT3/STAT3比值均较模型组和实验组明显降低(均P<0.001);miR-129-5p inhibitor组与实验组相比，p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01),siCaMK4组与实验组相比，p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.01)。

表2各组炎症因子水平的比较

图3用蛋白质印迹法检测信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化水平

三、讨论

银屑病是一种由免疫介导的皮肤疾病，主要表现为角质形成细胞过度增殖和炎性细胞过度浸润[9],不仅影响体表皮肤，还可引起关节炎、淋巴瘤、代谢综合征等并发症，严重影响患者生活质量。目前，临床上多用药物、理疗等方法缓解银屑病症状，但难以根治。

青蒿素是中药青蒿中的有效成分，具有广泛抗炎、抗肿瘤、免疫调节等药理活性[10]。江从军等[11]研究发现，青蒿素的衍生物双氢青蒿素可以改善银屑病小鼠的皮损，抑制表皮增生和促炎因子表达。本研究中HE染色结果显示，实验组银屑病小鼠皮损状态明显改善，且PASI评分及炎症因子水平均明显降低，提示青蒿素能够促进银屑病皮损愈合、抑制炎症反应，效果显著。

研究表明，多种miRNA在银屑病皮损组织和血浆中表达失调，可以通过调控下游靶基因参与银屑病的发生[12-13]。WANG等[12]研究发现，miR-383可以通过靶向结合脂质运载蛋白2抑制Janus激酶/STAT信号通路，抑制角质形成细胞增殖、促进凋亡，控制银屑病进展。YAN等[13]研究发现，miR-145-5p在银屑病中呈低表达；miR-145-5p可以靶向肌球蛋白轻链激酶3表达来抑制角质形成细胞增殖、抑制炎症反应。本研究结果发现，miR-129-5p在银屑病中呈低表达，CaMK4呈高表达。通过ENCORI数据库联合双荧光素酶实验结果可知，CaMK4是miR-129-5p的靶标，miR-129-5p可以负调控CaMK4表达。miR-129-5p在多种疾病中异常表达，上调miR-129-5p水平可以抑制炎症介质释放[14]。CaMK4属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，CaMK4低表达可有效缓解银屑病炎症反应，抑制角质形成细胞向促炎表型转化[15]。有研究发现，IL-17、IL-23等多种促炎因子的激活会导致炎症反应的发生及银屑病皮损的形成[16]。进一步研究发现，青蒿素可以上调miR-129-5p靶向负调控CaMK4表达，抑制炎症因子水平，促进银屑病皮损愈合，与上述研究结果基本一致。

STAT3是一种重要的转录因子，参与细胞增殖、分化及血管生成等多种生物学过程。有研究发现，STAT3在银屑病皮损组织中表达上调，对角质形成细胞和Th17分化起关键作用[17]。本研究结果发现，实验组的STAT3磷酸化水平较模型组明显降低，经青蒿素联合miR-129-5p低表达处理后，STAT3磷酸化水平较实验组显著升高，猜测青蒿素可能通过miR-129-5p/CaMK4轴抑制STAT3磷酸化水平，减少相关炎症因子，进而达到改善银屑病的目的。

本研究提示，青蒿素可以改善银屑病样皮损、抑制炎症水平，可能与介导miR-129-5p/CaMK4轴抑制STAT3表达有关。

参考文献:

[2]孟繁鹏,闫学文,刘栋,等.中医药治疗银屑病相关免疫机制研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2020,19(1):101—103.

[3]魏强,金权鑫,金琳博,等.双氢青蒿素通过抑制角质形成细胞的增殖和促炎因子的产生改善小鼠银屑病样皮肤炎症[J].中国免疫学杂志,2020,36(5):543—548.

[5]宋文荣,龚华平,张磊,等.lncRNA NEAT1调控miR-4262表达影响甲状腺癌细胞增殖､迁移和侵袭的机制研究[J].现代肿瘤医学,2020,28(8):1246—1251.

[6]曹翠香,侯海静,李其林.消退素D1对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型的治疗作用[J].中国皮肤性病学杂志,2019,33(3):275—279.

[7]杨年安,苏林冲,袁林,等.竹节参皂苷Ⅳa对膝骨关节炎大鼠的作用及机制[J].中国临床药理学杂志,2023,39(22):3321—3325.

[8]廖海泉,杨斌.雷公藤多苷对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损作用机制研究[J].中国临床药理学杂志,2021,37(3):288—291,301.

[9]张姗,刘红霞,欧韵.银屑病病因病机研究进展[J].皮肤病与性病,2017,39(1):27—30.

[10]廖媛,王钰婷,罗贤强,等.青蒿素类化合物抗肿瘤作用激活机制的研究进展[J].中草药,2021,52(11):3429—3435.

[11]江从军,周艳梅.双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究[J].蚌埠医学院学报,2022,47(10):1342—1346,1351.

[14]丁秀丽,祁秀丽,王誉霖.miR-129-5p对LPS引起星形胶质细胞炎性介质释放的影响和机制[J].河北医药,2021,43(20):3082—3086.

[15]雍亮.CaMK4在银屑病发病中作用及其机制研究[D].安徽合肥:安徽医科大学,2023.

[17]刘凤杰,栗玉珍.MAPK信号通路及STAT3､STAT5A/B在银屑病皮损中表达增高[J].实用医学杂志,2018,34(18):3020—3023.

文章来源:岑雯,马彦,贾晓强.青蒿素改善咪喹莫特诱导银屑病样小鼠的作用研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3136-3141.