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分泌型卷曲相关蛋白1对H9C2心肌细胞肥大的调控作用及机制

2025-07-25 44 上传者：管理员

摘要：目的探讨分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1对心肌肥大的调控作用及机制。方法通过血管紧张素(Ang)Ⅱ干预构建体外心肌肥大模型，通过心肌细胞面积测定、实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)实验检测心肌细胞肥大相关分子证实模型是否构建成功。RT-qPCR检测体外心肌肥大模型中SFRP1表达变化；构建SFRP1过表达的H9C2心肌细胞肥大模型，通过心肌细胞表面积测定观察各组细胞表面积变化；RT-qPCR检测各组细胞中肥大相关分子和钙调控相关分子表达变化；钙离子探针检测各组细胞中钙离子变化情况。结果与NC组相比，AngⅡ处理组H9C2细胞的表面积明显增大，且心肌细胞肥大相关分子心房钠尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(MHC)表达水平明显上调(P<0.05)。与AAV9组相比，SFRP1-OE组H9C2细胞的表面积显著缩小，且ANP、BNP和β-MHC表达水平明显降低(P<0.05);同时，RT-qPCR结果显示SFRP1-OE组细胞中钙调控相关分子肌浆网钙ATP酶(SERCA)2a显著上调和钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ的表达水平显著下调(P<0.05);SFRP1-OE组细胞内钙离子峰值上升时间和下降时间均较AAV9组显著缩短(P<0.05)。结论 SFRP1通过调控SERCA2a、CaMKⅡ表达维持细胞内钙稳态，进而拮抗AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

关键词：
SERCA2a
分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1
心力衰竭
心肌细胞肥大
钙稳态
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病理性心肌肥厚是心力衰竭的主要原因,对全球公共卫生安全构成了严重威胁｡目前,β⁃肾上腺素能受体阻滞剂和血管紧张素(Ang)⁃醛固酮系统抑制剂是改善病理性心肌肥厚的主要治疗方法〔1〕,但心力衰竭的发生率和死亡率仍然较高,表明其他信号通路或者调节蛋白在病理性心肌肥厚中发挥重要的调控作用｡因此,寻找病理性心肌肥厚的调控分子并阐明其作用机制对于寻找新的治疗靶点具有重要的临床价值｡

分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1是一种可以折叠成N端和C端两个独立区域的蛋白质,其N端富含半胱氨酸的区域可以通过二硫键与卷曲蛋白受体(FZD)结合〔2〕｡因此,SFRP1可以与Wnt蛋白的FZD相互作用抑制β⁃连环蛋白(catenin)累积并阻断其下游基因表达,进而抑制Wnt/β⁃catenin通路介导的疾病进程〔3〕｡据报道,Wnt信号通路在心脏发育和生理过程中起到重要作用,但过度激活会导致心肌细胞过度增殖和分化,导致病理性心肌肥大,从而引发心肌重塑和心功能不全〔4〕｡研究表明,SFRP1敲除后心脏成纤维细胞的α⁃平滑肌肌动蛋白表达､增殖率和胶原生成均增加〔5〕｡另一项研究表明,心肌梗死后30d小鼠过表达SFRP1后可导致心肌纤维化减弱､梗死面积减小及Wnt信号抑制〔6〕｡由此可见,SFRP1可能成为保护心脏免受心肌梗死损伤的治疗靶点｡但是,SFRP1在心肌细胞肥大中的调控作用尚不明确｡因此,本文探讨SFRP1在心肌肥大中的调控作用及机制｡

1、材料与方法

1.1构建体外心肌细胞肥大模型使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM完全培养基培养H9C2细胞,培养条件为37℃､5%CO2｡将培养完成的H9C2细胞分为:阴性对照(NC)组(未做任何处理的H9C2细胞)､AngⅡ处理组(1×10-7mol/LAngⅡ处理H9C2细胞48h〔7〕),通过分析两组心房钠尿肽(ANP)､脑利钠肽(BNP)和β⁃肌球蛋白重链(MHC)等胚胎期基因的表达变化和观察细胞表面积来验证模型是否构建成功｡

1.2细胞转染将处于对数生长期的AngⅡ干预的H9C2细胞按照1×105个/孔的密度接种到6孔板中,细胞密度约60%时进行转染｡阴性对照(AAV9)组转染AAV9空载体,SFRP1过表达(SFRP1⁃OE)组转染AAV9⁃SFRP1病毒载体,均按说明书使用浓度加入细胞培养液中,24h后更换新鲜培养基,72h后收集细胞进行转染效率鉴定｡

1.3鬼笔环肽染色将各组H9C2细胞按照1×105个/孔的密度接种至6孔板中培养,24h后弃掉培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,弃掉PBS,每孔加入1ml4%多聚甲醛固定15min｡弃掉多聚甲醛,PBS洗涤,每次洗涤10min,重复3次｡然后使用0.1%Triton⁃X透化液处理细胞,PBS洗涤｡洗涤后加入鬼笔环肽工作液,并于室温下避光孵育1h｡然后使用PBS洗涤,洗涤结束后每孔加入适量4′,6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚(DAPI)避光保存,最后使用荧光显微镜观察心肌细胞形态并拍摄图片,通过ImageJ软件分析每组细胞的细胞表面积｡

1.4实时荧光定量⁃聚合酶链反应(RT⁃qPCR)使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司总RNA提取试剂盒提取H9C2细胞中总RNA,然后检测各组细胞所提取出RNA的浓度｡每组均取1.0μg总RNA进行逆转录反应(具体步骤按照上海翊圣生物科技有限公司的HieffTM第一条链cDNA合成试剂盒的说明书进行)｡采用LightCycler96(美国罗氏)PCR仪进qPCR反应(反应体系按照上海翊圣生物科技有限公司的HieffUNICONUniversalBlueqPCRSYBRMasterMix试剂盒说明书配制)和结果分析｡反应条件:95℃预变性2min,95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸15s,共40个循环｡以GAPDH为内参,通过2-ΔΔCt法计算ANP､BNP､β⁃MHC､肌浆网钙⁃ATP酶(SERCA)2a和钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ的相对表达水平｡引物序列具体如下:ANP正向引物:5′⁃GGGGGTAGGAT⁃TGACAGGAT⁃3′,反向:5′⁃CTCCAGGAGGGTAT⁃TCACCA⁃3′;BNP正向引物:5′⁃TTAGGTCTCAAGA⁃CAGCGCC⁃3′,反向:5′⁃CGCCGATCCGGTCTATCTTC⁃3′;β⁃MHC正向引物:5′⁃AGTTGCCTCTTGAGGTCCTC⁃3′,反向:5′⁃GCAGATCATCAAGGCCAAGG⁃3′;SER⁃CA2a正向引物:5′⁃TATGCTGCCAAGACGGTGTT⁃3′,反向:5′⁃ACTGGATCAGAGGGCTGGAT⁃3′;CaMKⅡ正向引物:5′⁃GCCTACATCCGCATCACTCA⁃3′,反向:5′⁃CTGGCCTGGTCCTTCAATGG⁃3′;GAPDH正向引物:5′⁃TCCCTCAAGATTGTCAGCAA⁃3′,反向:5′⁃AG⁃ATCCACAACGGATACATT⁃3′｡

1.5观察各组细胞内钙离子变化将各组细胞接种于玻底皿中培养,当细胞密度约60%时弃掉培养基,然后加入含5μmol/L钙离子探针Fluo⁃3AM的不含血清的DMEM培养基中,常规培养40min后使用预热的培养基洗涤2次,更换新鲜培养基后常规培养30min｡然后利用激光共聚焦显微镜扫描并记录单个心肌细胞搏动时的荧光,以上升至峰值一半时所需的时间(t1/2α)､下降至峰值一半时所需的时间(t1/2β)表示胞内钙变化时间｡

1.6统计学分析采用SPSS27.0软件进行t检验｡

2、结果

2.1体外心肌细胞肥大模型构建成功如表1所示,与NC组相比,AngⅡ处理组细胞相对表面积明显增大(P<0.01),ANP､BNP和β⁃MHC表达水平明显上调(P<0.05)｡提示,H9C2心肌细胞肥大模型构建成功,可用于后续实验｡

表1两组心肌细胞相对表面积及ANP､BNP和β⁃MHC､SFRP1相对表达量(x±s,n=50)

2.2SFRP1在心肌细胞肥大模型中的表达水平显著降低如表1所示,AngⅡ处理组SFRP1表达水平与NC组相比显著降低(P<0.01)｡

2.3SFRP1过表达对H9C2细胞表面积的影响如表2所示,与AAV9组相比,SFRP1⁃OE组心肌肥大细胞模型中SFRP1表达水平显著上调(P<0.05)｡SFRP1⁃OE组较AAV9组能够明显缩小心肌肥大细胞模型的表面积(P<0.05)｡

2.4SFRP1过表达对H9C2细胞肥大相关分子表达的调控作用如表2所示,SFRP1⁃OE组细胞中ANP､BNP和β⁃MHC表达水平较AAV9组显著降低(P<0.05)｡

2.5SFRP1过表达对H9C2细胞钙调控相关分子表达的调控作用如表2所示,SFRP1⁃OE组较AAV9组能够明显上调SERCA2a表达水平,明显下调CaMKⅡ表达水平(P<0.05)｡

2.6SFRP1过表达对H9C2心肌细胞肥大模型中钙离子的影响如表2所示,SFRP1⁃OE组t1/2α和t1/2β较AAV9组均显著缩短(P<0.05)｡

表2两组心肌细胞相对表面积､ANP､BNP､β⁃MHC､SERCA2a､CaMKⅡ､SFRP1基因相对表达量及t1/2α､t1/2β比较(x±s,n=50)

3、讨论

病理性心肌肥厚是心室重构的生物学基础,其特征是心脏质量增加､心肌纤维化,最终导致心力衰竭〔8〕｡心肌肥厚是一种生理性和病理性负荷过重的适应性反应｡面对过重负荷时,个体心肌细胞会发生机械性拉伸,并激活细胞内的肥大信号通路,以重新利用胚胎转录因子并增加结构蛋白和收缩蛋白的合成〔9〕｡这些肥大反应增加了心肌细胞对氧的需求,导致心肌血管生成增加以缓解缺氧状况并维持心肌收缩功能｡然而,持续的病理性负荷过重会导致心肌重构,最终导致心力衰竭〔10〕｡

SFRP1是Wnt/β⁃catenin信号通路拮抗剂,在心脏发育和多种心血管疾病中有重要调控作用〔11〕｡但是,SFRP1在心肌肥大中的调控作用有待研究｡本研究结果显示,SFRP1在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中呈异常低表达水平,提示其可能参与心肌细胞肥大进程｡本研究将SFRP1转染至心肌细胞肥大模型中,发现SFRP1过表达能够缩小肥大心肌细胞的表面积｡研究表明,病理性心肌肥厚的一个主要分子特征是胚胎基因的重新表达〔12〕｡例如,高血压等病理性环境会引起应激程序的激活,包括ANP､BNP和β⁃MHC表达的增加〔13,14〕｡相比之下,生理性肥厚的一个重要特征是没有分子应激程序的存在〔15〕｡本研究结果显示,AngⅡ能够诱导心肌细胞中ANP､BNP和β⁃MHC的表达水平上调,而SFRP1过表达则能够逆转这种效应｡以上结果表明SFRP1过表达能够逆转心肌细胞肥大进程,但是具体的调控机制还需进一步探讨｡

心脏泵功能受细胞内钙离子浓度和兴奋⁃收缩耦联机制的调控〔16〕｡在病理性肥厚刺激(如压力负荷过大)下,心肌细胞会通过SERCA2a(在舒张期)增加钙离子从主要的细胞内钙离子储存库———肌浆网(SR)向胞质内的释放量,同时通过SERCA2a将钙离子重新吸收回SR〔17〕｡当需求无法得到满足时,心肌细胞会通过合成过量的收缩蛋白(肥大)来进行补偿,这会破坏心肌细胞内亚细胞结构之间的平衡,影响有效的钙信号传递､收缩和舒张及能量代谢,并导致血管供应不足｡这些变化共同导致心肌细胞死亡,包括细胞凋亡,进而引发炎症反应､纤维化和细胞外基质异常积聚〔14〕｡过度积聚的胶原蛋白会使心室变硬,进一步影响收缩和舒张,并降低毛细血管密度｡这种对心室壁的不利结构重塑会增加氧气扩散的距离,导致心肌缺氧,从而促进从肥厚到衰竭的转变〔18〕｡

研究表明,降低的SERCA2a表达/活性可能通过其辅助磷酸蛋白磷脂酰肌醇酰转移酶或者CaMKⅡ的直接磷酸化调节心肌泵功能,并引发一系列的补偿性反应,包括慢性激活神经内分泌途径和肥厚基因编程,最终导致失代偿和心力衰竭〔19〕｡本研究结果提示,SFRP1通过调控SERCA2a和CaMKⅡ维持钙稳态抑制心肌细胞肥大进程｡

综上,SFRP1在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中呈异常低表达状态,且AngⅡ能够诱导心肌细胞中ANP､BNP和β⁃MHC表达水平上调,而SFRP1过表达则能够逆转这种效应;SFRP1过表达能够通过调控SERCA2a和CaMKⅡ维持钙稳态抑制心肌细胞肥大进程,为病理性心肌肥厚的临床治疗提供了新靶点｡

参考文献:

5陶静,魏娴,马依彤.Wnt/β⁃catenin信号通路在Sfrp1抑制乳鼠心肌纤维化中的作用及机制〔J〕.山东医药,2019;59(23):10⁃3.

基金资助:吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20200056KJ);吉林省卫生与健康技术创新项目(2020J018);北华大学研究生创新计划(北华研创合字[2023]029);

文章来源:邹德利,何玉,常学锋.分泌型卷曲相关蛋白1对H9C2心肌细胞肥大的调控作用及机制[J].中国老年学杂志,2025,45(14):3501-3504.